美国密西西比大学Christian R. Gomez博士于2018年发表在Clinical Lymphoma, Myeloma & Leukemia的文章Genetic Mutations in B-Acute Lymphoblastic Leukemia Among African American and European American Children
摘要
与欧美儿童相比，患有急性B-淋巴细胞白血病的非裔美国儿童的存活率较低。为了发现种族特异性遗传异常导致人群特异性风险，我们进行了一项全外显子组测序研究。虽然大多数基因畸变在两个群体之间是共同的，但很少是针对每个种族的。我们的研究揭示了遗传变异，为解释种族特异性白血病的发生提供了线索。
背景：与欧美儿童（EA）相比，非裔美国人（AA）儿童急性B-淋巴细胞白血病（B-ALL）患者的生存率明显较低。在这里，我们提出了一项完整的外显子组测序（WES）研究，显示种族特异性基因变异可能在患有B-ALL的AA和EA儿童的不同结果中发挥作用。
患者和方法：入选5例AA和15例EA患者，年龄从1岁到18岁。原始细胞比例百分比中位数为94.8%（范围64.5%-99.9%）。冷冻骨髓抽提物用于提取DNA，并进行WES，重点关注种族和B-ALL特异性种系突变。
结果：大多数遗传变异（n=339）在AA和EA儿童之间共享。一些基因畸变仅在AA（n=58）和EA（n=52）中发现，在AA中，基因畸变聚集在与端粒酶信号和癌症信号相关的典型途径中。在EA中，独特的遗传畸变聚集在与干细胞多能性和遗传性癌症相关的途径中。
结论：我们的研究揭示了信号网络中的异常遗传畸变，这可能有助于特定种族的白血病发生。我们的结果表明，WES作为一种工具，对患有B-ALL的AA和EA儿童的个体基因特征和基因评分的发展具有价值。这些发现可能最终影响疾病管理，并有助于消除患有B-ALL的AA儿童出现的不同结果。
介绍
急性淋巴细胞白血病（B-ALL）是美国诊断的最常见的儿童恶性肿瘤。白血病几乎占所有儿童癌症的三分之一（29%）。在儿童和青少年中，大约四分之三的白血病是急性淋巴细胞白血病（ALL）。它是儿童癌症相关死亡的主要原因。在过去的几十年中，被诊断为B-ALL的儿童的死亡率和发病率有了显著的提高，现在总的5年生存率超过85%。这在一定程度上是由于多药化疗的疗效和根据患者特征、白血病生物学特征和早期治疗反应（如第8天或第15天骨髓）对治疗强度进行风险分层的进展。这些进展预示着将白血病基因组学整合到当代治疗中的精确医学策略的前景和挑战。
尽管取得了这一进展，但基于种族和种族差异的B-ALL患儿治疗方面仍存在未满足的需求。早期的研究表明，不同种族和族裔群体的存活率不同。在Bhatia等人的多变量分析中，非裔美国人（AA）、西班牙裔、亚裔和欧美裔（EA）儿童的生存率不同，其中AA和西班牙裔儿童的预后更差。AA儿童的发病率和存活率明显低于EA儿童。这些结果表明，不明分子因素可能在AA儿童较低的存活率中起作用，并强调需要进行前瞻性调查分析。虽然遗传的个体间遗传变异（通常与种族或族裔群体的地理祖先有关）可能导致种族和族裔差异，但“候选”途径中的遗传变异对所有种族差异的影响结果不一致。我们目前对白血病发生始发事件的理解仍然不足以解释健康差异和治疗耐药性的生物学和分子基础。高通量微阵列、基因分型和下一代测序（NGS）技术为白血病发生、耐药性和宿主药物基因组学提供了新的见解，从而确定了新的白血病亚型并提出了潜在的治疗靶点。
大多数B-ALL患者反复出现结构性染色体重排，这是白血病发生的重要始发事件，但不足以解释健康差异和抗药性的分子基础。B-ALL基因组图谱的最新进展，包括全基因组关联研究（GWAS），使人们进一步了解了该疾病的遗传背景，并发现了可能影响种族差异的不同遗传因素。GWAS已经确定了5个可能在B-ALL发病机制中起作用的基因组位点。候选基因关联研究的荟萃分析确定了可能影响B-ALL风险的16个基因多态性变异的47项研究，并在25个多态性变异中仅观察到8个具有统计显著性（P<0.05）关联，估计假阳性概率大于0.2。
一项研究表明，ARID5B单核苷酸多态性49个中有10个与EA和西班牙裔之间B-ALL易感性的种族差异有关，并在随后的研究中得到验证。因此，遗传多态性可能是B-ALL人群特异性风险的生物学基础。这些研究已经确定了儿童癌症的潜在治疗靶点和驱动突变。然而，为了剖析健康差异的分子基础，目前还没有最佳研究设计或分析策略的黄金标准。此外，目前的治疗成功率是建立在使用细胞毒性化疗和放射疗法的基础上的，这些化疗和放射疗法通常会产生显著的不良反应，最终会降低幸存者的生活质量。
材料和方法
病人
在研究开始之前，密西西比大学医学中心（UMMC）获得了机构审查委员会（IRB 2013—0250）的批准。书面知情同意书由每个孩子的父母或监护人提供。来自UMMC的20名新诊断疾病的B-ALL独立儿科患者被纳入本研究。表1总结了患者的人口统计学，包括疾病特征和其他血液学指标，通过骨髓差异计数进行评估。儿童年龄介于1至18岁之间，平均年龄为4岁。其中11人（55%）为女性，9人（45%）为男性。5例（25%）为AA，15例（75%）为EA。回顾了临床病史、血象、流式细胞术、免疫表型、形态学、细胞遗传学和先前的分子数据。
在我们的研究中，只有1名患者在治疗后复发，并于2017年底死亡。骨髓样本中的细胞百分比中位数为100%（范围70%-100%），AA为100%（范围100%-100%），EA为100%（范围70%-100%）。原始细胞的中位数百分比为94.8%（范围64.5%-99.0%），AA为94.5%（范围86.0%-98.5%），EA为95.0%（范围64.5%-99.0%）。大多数患者接受了3或4种治疗药物的方案，包括长春新碱、聚乙二醇化糖皮质寡糖天冬酰胺酶和地塞米松/强的松或长春新碱、聚乙二醇化糖皮质寡糖天冬酰胺酶、柔红霉素和地塞米松/强的松。此外，患者给予鞘内阿糖胞苷和甲氨蝶呤。药物管理通常在样本采集后1至2天开始。
DNA提取与WES
在2013年至2016年期间，根据研究方案在诊断时收集了骨髓抽吸物（5 mL），并获得了所有参与者的知情同意。新鲜骨髓样本通常经过处理，用于分子分析，包括。然而，本研究的样本在采集时常规冷冻和储存。由于冷冻骨髓样本可用于DNA提取，且与WES兼容，因此我们决定对样本的提取技术进行标准化。骨髓样本解冻并过滤以清除骨或脂肪残留物。按照制造商的方案（Qiagen，QIAmp DNA血液试剂盒），使用200ml冷冻骨髓抽提物提取DNA。加入RNAseA以消除RNA的空间。典型产率约为5.0±7.2mg，OD260/280纯度比接近1.8被认为是可接受的。进一步的质量控制在UMMC的分子和基因组中心进行。在量子化荧光光度计上进行高灵敏度定量，并在RNA生物分析仪（Agilent Technologies）上运行样品。可接受的DNA量(总计>200 ng)，生物分析仪中没有RNA峰表明处理测试样品成功。
文库制备在位于路易斯安那州新奥尔良路易斯安那州立大学健康科学中心斯坦利S.斯科特癌症中心的翻译基因组核心完成，使用50 ng DNA的TRUSEQ外显子组样本制备试剂盒（Illumina）。对核酸进行机械破碎（Covaris Inc.）以产生150 bp的片段。对片段进行纯化，并通过扩增步骤，获得包含指数的适配器序列，以便在分析步骤中分离样品。通过聚合酶链反应扩增文库，使用安捷伦生物分析仪2100测定文库质量，并通过荧光测定法（Qubit）定量。使用Illumina（TruSeqExome）提供的试剂和说明，以2×75 bp（配对末端方案）的长度对文库进行测序，该文库提供至少75×覆盖率（8个样本pool）。简单地说，将汇集的文库（每个文库8个）调整到1.8pM，并通过含有寡核苷酸的流细胞冲洗，寡核苷酸是适配器的组成部分。然后将该池“固定”到离流细胞上并原位扩增。每个DNA分子作为簇生成的模板。聚类后，样本在NextSeq500 Illumina测序仪中进行测序。使用SCS v2.10/RTA v1.9软件（Illumina）执行Base calling。
生物信息学分析
通过NGS管道分析WES，包括mapping、质控和变体calling3个步骤。首先，来自Illumina NextSeq的所有样本通过(fastqc:http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)质量控制，使用Burrows-Wheeler比对（BWA，http://bio-bwa.sourceforge.net/)，为每个样本生成4个双端BAM文件。其次，为了提高校准质量，我们使用宽GATK Realigner（GATK:https://software.broadinstitute.org/gatk/)为了减少INDEL的错误次数，然后进行基本质量分数重新校准，以减少测序机产生的伪影，并用Picard对每个BAM文件标记聚合酶链反应的重复。我们通过合并4个配对端重新校准和校准的BAM获得样本级BAM。在第三步中，Varscan(http://varscan.sourceforge.net/)调用每个样本的变体调用（单核苷酸多态性--SNPs和INDELs）并由ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)用于基于基因的变异功能注释。与基因功能障碍相关的任何单核苷酸变异和插入/缺失（INDEL）（即非同步单核苷酸变异、移码插入/缺失）被总结为基因水平畸变。
结果
对2013年至2016年间在UMMC儿童医院接受B-ALL治疗的20名儿童患者（5例AA和15例EA）诊断时获得的冷冻骨髓DNA进行WES（~100倍）。为了比较AA和EA之间的群体差异，我们将重点放在种系突变上，因为它们可以反映群体遗传信息，并且可以从上一代遗传。为了进一步区分突变类型，我们将我们的结果与565个最可靠的儿童癌症易感基因进行种系突变分析。Zhang等人22通过仔细审查美国医学遗传学和基因组学学院的基因列表和PubMed文献检索，总结了这些基因。从我们的结果中，我们发现449个具有种系突变的基因与565个基因列表重叠。大多数（n=339）在AA和EA之间共享（图1），包括存在于间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶（ALK）基因中的那些（图2）。我们发现一些遗传异常对AA（n=58）是特异性的，如5例患者的脂肪瘤首选伙伴基因（LPP）（图2），4例患者的TNF-α诱导蛋白3（TNFAIP3）和黑色素前体蛋白（PMEL）。
例如，在8名患者中发现白血病抑制因子受体（LIFR），其中7名患者的LIFR基因第17外显子p.V785I处发生错义突变，如图2所示。表3总结了具有非同义种族特异性种系畸变的最常见基因。
图1 AA和EA独有的胚系突变情况
图2 来自不同群体的大多数突变基因的种系位点突变示例
表3 排除非裔美国人与欧洲裔美国人共有突变，具有非同性畸变的前10种种系基因
我们进行了一项通路分析，试图建立与观察到的畸变相关的参数（ingenuity通路）。该分析表明，与种族无关，显示与疾病和生物功能相关的畸变的通路与癌症、遗传性疾病、器官损伤和异常有关，血液病。有趣的是，AA（表4）和EA（表5）之间的标准路径不同。对于AA而言，与端粒酶信号传导、干细胞多能性、癌症信号传导、急性髓系白血病和慢性髓系白血病相关的途径表明生殖系畸变的发生率较高。在EA中，与干细胞多能性、遗传性癌症、同源重组和癌症转移相关的基因中的畸变更为普遍。
表4
表5
讨论
高通量NGS技术的使用一定程度促进了人们对B-ALL患者差异遗传基础的理解。然而，目前还没有一个最佳的研究设计或分析策略的标准来划分健康差异的分子基础。通过高通量基因分型，对患有B-ALL的儿科患者进行的多个GWAS研究已经完成，并且在EA中发现了许多遗传易感性位点。然而，缺乏关于AA的研究，最近的数据表明，并不是所有B-ALL的风险等位基因都将通过仅限于EA的研究揭示出来。我们对整个外显子组进行测序，以剖析患有B-ALL的AA和EA儿童患者中健康差异的分子基础。通过努力，在患有B-ALL的AA和EA儿童中发现了特异的白血病发生分子。种族特异性变异可能导致白血病的人群特异性风险，并阐明AA和EA人群之间潜在健康差异的分子机制。此外，我们的研究结果表明，WES作为一种工具对于患有B-ALL的AA和EA儿童个体基因特征和基因评分的开发具有价值。
遗传变异的普遍性可能导致患有B-ALL的AA和EA儿童在发病率和结局方面的差异。本研究揭示的异常生物网络为区分具有种族特异性非同义变异的种系基因提供了信息。这些发现在将来可以为针对相关问题的研究提供线索，例如与建立体细胞突变相关的研究。可能参与种族特异性白血病发生的基因畸变和信号网络。示例（图2）包括PPP-AAs和LIFRIN-EAs。在所有AA患者中都发现了LPP的变体。LPP作为细胞核中的一种特异性共激活剂，并在细胞迁移中发挥作用。已发现LPP在脂肪瘤中上调，因为它在平滑肌细胞中起作用，尽管之前尚未显示，我们的研究表明LPP可能在种族特异性白血病发生中发挥作用。当然，后者可能是由于缺少足够的公开信息。在15例EA患者中，有8例发现了LIFR的变异。
LIFR的过度表达与各种实体瘤有关，包括乳腺癌、皮肤癌、结直肠癌和鼻咽癌。有报道称，这些基因在B-ALL患儿中的表达。然而，它们在预测癌症特异性疾病中的适用性尚不清楚。我们研究的限制因素是仅限于一个治疗地点的小样本量以及与正常人群比较的可行性。这些局限性妨碍了与正常人群相关的特定等位基因种族特异性风险的研究。此外，我们没有将基因变异与差异基因表达和临床数据（包括复发率）联系起来。
结论
总之，我们的研究结果表明，在患有B-ALL的儿童患者中，种族相关WES基因特征的聚集可能有助于改善其骨髓抽吸物的预后分类。将来，本研究衍生的生物标志物小组可能有助于指导风险分层、药物开发和治疗决策，以帮助减少患有B-ALL的AA和EA儿童的医疗差异。