GROMACS Tutorial 1: Lysozyme in Water 中文实战教程

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前言

因为我觉得GROMACS官方英文教程和李继存老师的GROMACS的中文教程对于新手非常不友好，并且有很多细节的地方并没有详细说明，导致有很多困难的地方。这里记录一下自己成功的实验案例。

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系统环境

电脑系统：win11（大部分操作） linux：ubuntu22.04 （小部分操作）
我知道gromacs很多在linux上搞，但我就要在windows上搞，windows可以很方便的可视化
python环境：3.6.13
大家还是最好创建一个新的conda环境，我以前就是用的3.11的python结果很多地方报错，最好还是和我用的版本一样
gromacs版本：gmx2020.6_AVX2_CUDA_win64
英文官方教程推荐using a GROMACS version in the 2018.x series，别用老的，老的以前不能使用gpu加速，之后处理会非常慢，除非你用超算，但这就不属于个人电脑能处理的，我是希望能在自己的电脑上跑出来
GPU：GTX1060 6G
相当老的甜品级显卡了，不要用AMD的显卡就行
重要软件：VSCode
我们很多操作都在用VSCode打开并且修改，必须要有，vscode里也装上gromacs的插件，更好看一点
其他软件：pymol3.8 VMD Avogadro（前两个是为了可视化，最后一个这个教程不是必须）
如果环境不会搭的话我会再出一期专门配置环境的，环境配置并不是我们这次教程的重点

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这章GROMACS英文教程地址：[GROMACS英文教程地址](http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/index.html)

特别强调

我们所有在的命令操作都要在工作目录中进行！
比如我的下载的文件在D:\Code\ChemCode\Gromacs\test001\resource这个文件夹中。
无论你采用那个命令输入方式（cmd或者用powershell或者用anaconda prompt）
都要提前切换到工作目录中，再进行命令的输入

这是我放文件的地方

点击这里输入cmd

这样才算进入工作目录

如果你是win+r然后输入cmd

这并不是我们的工作目录
输入

cd /d D:\Code\ChemCode\Gromacs\test001\resource

来切换到我们的工作目录。

我比较推荐大家使用conda环境中的anaconda prompt，因为后面涉及一些python的操作。打开anaconda prompt，创建你需要的python环境，激活。操作和cmd中一致。我就不放图了。

一、预处理阶段

我先放英文教程，再说我的。

这次处理的是针对egg white lysozyme (PDB code 1AKI)，我们要在PCSB PDB这个网站中下载我们需要的1AKI蛋白
搜索1AKI点进去

点击downloadfiles

我们下载PDB format格式即可
1AKI这是单链在下载PDB format无所谓 ，后缀有gz是在linux上使用，如果我们要处理的蛋白质是多链的话，若多链下载时注意使用Biological assembly

1.1 补全原子或残基

我们有时候下载的pdb文件中有MISSING字段。用vscode打开下载的pdb，ctrl+f后输入MISSING，并没有MISSING字段。但是在别的pdb文件中可能有，没有的话就跳过这一步。
如果有MISSING字段
使用spdbv打开下载的pdb

这里我用的4NRM蛋白

一打开提示有缺失原子

spdbv自动会补全缺失原子，粉色为补全原子
针对缺失残基：1、同源模建 2、直接在C端加上氧原子（在bulid里点击add C-termnal Oxygen）
我推荐针对缺失残基使用第二种方法。

之后点击file然后save as保存为pdb文件即可。之后操作在保存的文件中进行。

1.2 删除水分子

涉及命令
linux：grep -v HOH 1aki.pdb > 1AKI_clean.pdb
如果我们在linux上执行，直接在我们的工作目录中打开终端，然后输入这个命令，我解释一下，grep是搜索，-v是反选，搜索1aki.pdb中除了HOH以外的文本把他们输出成1AKI_clean.pdb这个文件，我们如果用windows中无论是cmd命令窗口还是powershell中都无法识别grep，所以我们要在windows中处理
Windows：需要我们手动处理，TER以下的水分子直接删
用vscode打开我们下载的1aki.pdb文件

我们把他复制一下，重命名为1aki_clean.pdb
重命名是为了不破坏源文件，注意我们之后的所有操作都是名字和命令符要对应上的

打开1aki_clean.pdb后长这样
我这里打开的是1aki.pdb，是为了给你们看一下有HOH的样子，你们操作的时候在1aki_nonHOH.pdb中操作

往下拉，找到终止位TER

直接删除HOH所在的行，注意是删HOH所在行，别删成别的了，删到CONECT之前就行了，ctrl+s保存即可。

1.3 生成top文件等位置限制文件

gmx pdb2gmx -f 1AKI_clean.pdb -o 1AKI_processed.gro -water spce

我这里处理完水后的名字叫1AKI_noHOH.pdb，你换成你们处理完水后的pdb文件名就行
顺便解释一下命令的意思，用1AKI_clean.pdb生成gromacs文件1AKI_processed.gro，并选择相应力场及水模型
之后选择力场从而生成拓扑文件

Amber力场比较规范化，若涉及有机小分子优先使用amber力场
使用的amber03的立场和spce的水模型，也就是选择相应的数字输入即可。

输出成功后显示总电荷为8e 成功生成
输出这三个文件

.gro第一个是结构文件，用vscode打开可以看到，是根据残基将其他分类包含残基和坐标信息，最后一行是盒子大小。相比pdb文件只包含原子信息

.top代表拓扑文件，记录力场信息和分子类型，原子信息包括原子类型、原子电荷、原子质量等

还包括键的参数

.itp位置限制文件，itp是top的一部分，其中还包括水分子的拓扑信息
如果还有别的分子加入，则必须先有对分子的拓扑，再加上第二个分子的位置限制，这个我们在第五个实验，蛋白质与配体配对时，我们需要手动的添加配体信息。
生成这三个文件，我们预处理阶段算是完成。

二、定义盒子及添加溶剂

2.1 定义盒子

跟着官方教程继续走

gmx editconf -f 1AKI_processed.gro -o 1AKI_newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic

用我们生成的gro的结构文件，去生成对应的盒子，cubic是立方体，后面我们也会用到十二面体，-d是设置截断半径，需要在计算效率和计算参数找到一个平衡点，一般为蛋白质自身宽度+一半阶段半径

结果

生成这个文件

2.2 加入溶剂

往盒子中添加溶剂

gmx solvate -cp 1AKI_newbox.gro -cs spc216.gro -o 1AKI_solv.gro -p topol.top

一共生成生成这些文件

#topol.top.1#是旧的top文件 topol.top是新的top文件
用新生成的topol.top对比我们1.3步之后生成的topol.top文件
相比之前的top多了溶剂分子 SOL就是溶剂水


官方教程中有10832个溶剂，而我只有10644个，这个不碍事，可能是我们使用的gromacs2020和2018之间版本的问题
禁止手动修改SOL的数字，否则后续会报错！！！
我们可以用pymol或者vmd来查看生成的盒子信息

可以看出，蛋白质在盒子最中心，溶剂分子包裹蛋白质

三、添加离子

3.1 使用mdp参数文件生成tpr文件

我们在1.3步中得到我们的蛋白质带8e的电荷
因为现在是一个带电的蛋白质的溶剂体系，由于生命体系中净电荷为0，我们必须将抗衡离子添加到我们的体系中
添加离子的工具称为genion，genion将指定离子替换为水分子并生成tpr文件，采用GROMACS grompp 模块，genion默认使用的盐为NaCl
tpr文件中包含系统中所有原子的参数，若要生成tpr文件，需要mdp文件，grompp 会将 .mdp 文件中指定的参数与坐标和拓扑信息组合在一起，以生成 .tpr 文件
mdp是整个gromacs中最重要需要手动修改的参数文件，需要做出个性化的调整
现在我们工作目录中创建一个新文件，命名为ions.mdp。
（我推荐在vscode里打开工作目录，之后的操作就在工作目录中了。）

在工作目录中创建新文件ions.mdp
点击这里，将里面的东西全选（ctrl+a）复制粘贴到ions.mdp中

将gro文件与mdp组合在一起生成tpr文件

gmx grompp -f ions.mdp -c 1AKI_solv.gro -p topol.top -o ions.tpr

3.2 离子的加入

对二进制文件 ions.tpr 中对体系进行了原子水平的描述，并传递给genion，并且添加pname阳离子NA和nname阴离子CL

gmx genion -s ions.tpr -o 1AKI_solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral

选择13组SOL进行包埋离子，离子要替换掉的对象一定是溶剂

在vscode中查看输出的top文件

加了8个CL离子来平衡八个正电荷
我们用pymol可视化一下，隐藏掉水分子，我们能明显看到有八个CL离子

3.3 添加离子特别注意事项

针对3.2步特别注意，在不同的立场中，相同离子的名称可能不一样，在amber03力场中钠离子就叫NA，氯离子叫CL，但是在有些立场中，例如charmm36立场中，钠离子依然叫NA，但氯离子叫CLA，查看力场在我们gromacs文件夹下，例如我的gromacs2020.6_GPU中，力场文件就在gmx2020.6_GPU\share\gromacs\top这个文件夹下。

因为我们在1.2步选择时amber03力场，打开amber03.ff
其中ions.itp就是保存着对应离子的名称

我们用vscode打开ions.itp
把他拖到vscode图标里就能打开了
ctrl+f搜索NA就能搜到，在amber03力场中氯离子叫CL

我们用相同的方式打开charmm36力场
这里的氯离子就叫CLA
at type才是计算机识别的名称类型
因此我们在添加离子时，要注意力场文件中的原子名称是否对应上，否则gromacs就会报错！

四、能量最小化

4.1 用mdp配置文件生成能量最小化的tpr文件

能量最小化能够有效避免直接模拟后体系崩溃
还是现在工作目录中创建minim.mdp文件
点击这里将里面的东西全选（ctrl+a）复制粘贴到minim.mdp中

为能量最小化生成tpr文件中包含系统中所有原子的参数

gmx grompp -f minim.mdp -c 1AKI_solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr

生成

4.2 进行能量最小化处理

gmx mdrun -v -deffnm em

用了897步使得能量小于1000
生成这些文件

4.3 可以做个图看一下最小化的过程

gmx energy -f em.edr -o potential.xvg

选择10 0
输入10 0 中间有个空格

用vscode查看生成的potential.xvg文件
我用python做了图
注释的地方是有的地方用了n步平均值，这里并没有用到我就注释了
后面所有的图都是那这个改的，改改路径什么的大家自己来咯，要改的地方也就FILE_PATH、START_LINE、plt.plot里label的名称、plt.xlabel、plt.ylabel、plt.title、plt.savefig的名称，大家按照xvg的里面的内容自己改一改^_^

import matplotlib.pyplot as plt
import numpy as np
FILE_PATH = r'D:\Code\ChemCode\Gromacs\test001\resource\potential.xvg'
START_LINE = r'@ s0 legend "Potential"'
plt.rcParams['font.sans-serif'] = 'SimHei'

with open(FILE_PATH, 'r') as file:
    lines = file.readlines()

x_values = []
y_values = []
data_started = False


for line in lines:
    if data_started:
        parts = line.split()
        if len(parts) >= 2:
            x_values.append(float(parts[0]))
            y_values.append(float(parts[1]))
    elif line.startswith(START_LINE):
        data_started = True


plt.figure(figsize=(10, 6))

# plt.xlim(0, max(x_values))
# plt.xticks(np.arange(0, max(x_values)+1, step=20))

plt.plot(x_values, y_values, label='Potential')
plt.xlabel('Time (ps)')
plt.ylabel('(kJ/mol)')
plt.title('GROMACS Energies')
# window_size = 10
# running_average = np.convolve(y_values, np.ones(window_size)/window_size, mode='valid')
# plt.plot(x_values[window_size-1:], running_average, label=f'Running Average ({window_size}-ps window)', color='red')
plt.legend()
plt.grid(True)


plt.savefig('Potential.png', dpi=300, bbox_inches='tight')
plt.show()

看一下做的图

五、平衡模拟

对整个体系进行位置限制性模拟，也就是对溶剂和离子进行弛豫同时保持蛋白质原子的位置不变. 在位置限制性模拟中会限制(或部分冻结)大分子中的原子位置，设置体系的温度和压强，nvt中设置温度，npt中设置压强

5.1 nvt模拟

5.1.1 用mdp配置文件生成nvt的tpr文件

还是现在工作目录中创建nvt.mdp文件
点击这里将里面的东西全选（ctrl+a）复制粘贴到nvt.mdp中

gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr

生成

5.1.2 进行nvt模拟

gmx mdrun -v -deffnm nvt

生成

5.1.3 画图查看nvt平衡过程

gmx energy -f nvt.edr -o temperature.xvg

选择16 0
生成

画图xvg
画图的代码大家按照4.3步和新生成的xvg图像自己改一下吧^_^
这里用到了10ps的平均值，大家要把注释掉的部分加回来

5.2 npt平衡

5.2.1 用mdp配置文件生成npt的tpr文件

还是现在工作目录中创建npt.mdp文件
点击这里将里面的东西全选（ctrl+a）复制粘贴到npt.mdp中

gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr

生成

5.2.2 进行npt模拟

gmx mdrun -v -deffnm npt

生成

5.2.3 画图查看npt平衡过程

gmx energy -f npt.edr -o pressure.xvg

选18 0
生成

画图xvg
画图的代码大家按照4.3步和新生成的xvg图像自己改一下吧^_^
这里用到了10ps的平均值，大家要把注释掉的部分加回来

还有个density的图

gmx energy -f npt.edr -o density.xvg

选24 0
画图

六、成品模拟

6.1 为MD配置mdp文件

还是现在工作目录中创建md.mdp文件
点击这里将里面的东西全选（ctrl+a）复制粘贴到md.mdp中

gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr

生成

6.2 开始MD模拟

我们的初衷就是在gpu上模拟，所以在后面选项加上-nb gpu

gmx mdrun -v -deffnm md_0_1 -nb gpu

因为我们md.mdp文件中nsteps设置的50w，50w steps在我的1060上预计10分钟跑完

生成

七、分析结果

RMSD 均方根偏差：反应某时刻结构相对于初始构象的偏差
RMSF 氨基酸残基的波动：每个氨基酸残基随时间的平均偏移参考位置的情况
RMSF值高说明该氨基酸或基团表现出较大的柔韧性，反之则柔韧性较差

7.1 修正坐标

因为我们在创建盒子时，有些原子处于盒子的边缘，一半在盒子内，一半在盒子外（也不是在盒子外，在另一个盒子里探出头，这个涉及到PBC周期型边界条件，有机会再讲）
使用trjconv来手动提取坐标、纠正周期性或者手动调整轨迹，使用trjconv消除体系的周期性

gmx trjconv -s md_0_1.tpr -f md_0_1.xtc -o md_0_1_noPBC.xtc -pbc mol -center

选择1作为体系进行偏移

选择0为输出结果

矫正之后的模拟结果

7.2 RMSD分析

获取RMSD的xvg的文件

gmx rms -s md_0_1.tpr -f md_0_1_noPBC.xtc -o rmsd.xvg -tu ns

选择4 backbone作为最小二乘法拟合以及RMSD计算
获得RMSD的xvg的文件

也可以获取相对于结晶结构的RMSD

gmx rms -s em.tpr -f md_0_1_noPBC.xtc -o rmsd_xtal.xvg -tu ns

画图

基本在0.1nm 1A以下，相当稳定

7.3 Rg分析

查看蛋白质的均方回转半径（Rg）可以描述其紧密程度，如果蛋白质处于稳固的折叠状态，Rg会处于一个相对稳定值。如果蛋白没有折叠，Rg会一直变化。

gmx gyrate -s md_0_1.tpr -f md_0_1_noPBC.xtc -o gyrate.xvg

选择1 针对蛋白质
生成
画图

从Rg相对合理的稳定值可以发现，在300K温度下1ns的模拟中，蛋白质处于非常稳定的折叠状态。

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总结

到这里第一章关于egg white lysozyme的gromacs教程就结束啦，因为我的专业是软件工程，gromacs有时候科研的时候会用到，踩了很多坑，希望学弟学妹们就别绕远路了。关于第五章和环境配置的部分我有时间再写，如果反响好的话。