2021年10月，Tzipilevich等人，在Cell Host&Microbe（细胞宿主与微生物）29期上发表了一篇名为：Plant immune system activation is necessary for efficient root colonization by auxin-secreting beneficial bacteria 的文章，主要描述了在植物根系定植过程中，细菌与植物免疫系统之间的相互作用关系。
【Cite】
Tzipilevich, Elhanan et al. “Plant immune system activation is necessary for efficient root colonization by auxin-secreting beneficial bacteria.” Cell host & microbe vol. 29,10 (2021): 1507-1520.e4. doi:10.1016/j.chom.2021.09.005
【摘要】
尽管植物根系在土壤中遇到过多的微生物，植物也会对根系细菌定植体施加选择性的作用力。与病原菌的免疫识别不同，有益细菌的选择机制以及它们如何与植物免疫系统相互作用尚不清楚。为了更好地理解这一过程，我们研究了产生生长素的芽孢杆菌Bacillus velezensis FZB42与拟南芥根系的相互作用，发现植物免疫系统的激活对于生长素分泌细菌有效定植是必要的；并建立了一个反馈回路（下图），在该回路中，细菌定植触发免疫反应并产生活性氧，进而刺激细菌产生生长素，生长素促进细菌存活和有效的在根系定殖，使细菌能够抑制真菌感染并促进植物健康。因此，细菌和植物免疫系统之间的反馈回路促进了双方的适应性。
【亮点】
1）生长素分泌细菌B.velezensis触发拟南芥免疫应答；
2）细菌生长素共同作用植物免疫应答和ROS毒性；
3）在反馈回路中，ROS诱导生长素和增加植物根系定植；
4）B.velezensis的免疫调控增强了植物对真菌感染的保护。
【研究背景】
细菌可以对植物产生致病、有益或中性的影响。细菌多样性从土体到根系到跟内依次减小，这表明了植物对其定殖细菌施加了选择力。
植物用于识别和响应细菌和其他生物体的早期过滤器是其免疫系统，该系统利用受体识别称为MAMP（微生物相关分子模式）的细菌分子，这些包括鞭毛、肽聚糖、细菌延伸因子TU等等，识别这些分子会导致一连串的分子事件。这种反应的最早阶段包括钙离子外流和活性氧（ROS）爆发，随后是导致免疫相关基因诱导的磷酸化事件。
Bacillus velezensis FZB42 （B.velezensis）是一种革兰氏阳性土壤细菌模型，可合成大量次级代谢产物，抑制植物病原体的生长，它还合成生长素，一种影响植物生长许多方面的植物激素。外源生长素添加的显著反应是阻止初生根生长和刺激侧根形成。
细菌分泌的生长素对植物生长的影响已经探索了几十年。细菌生长素可以控制植物生长，可能为细菌提供营养，细菌生长素还可以通过与水杨酸信号通路的拮抗作用抑制植物免疫系统。
【详细研究结果】
【1.细菌生长素在根定植过程中起着双重作用】
为了表征细菌与植物根系之间的相互作用，我们将B.velezensis接种到生长在琼脂平板上的拟南芥幼苗上。与先前的结果一致（Fan等人，2011年；Idris等人，2007年），与用缓冲液（模拟）处理的幼苗相比，培养7天后，定殖植物的初生根生长减少，侧根出现增加（图1A、S1A和S1B），这一反应与细菌生长素分泌一致（例如，Spaepen et al.，2014）。表达生长素反应报告基因（DR5:：GFP Liao et al.，2015）显示，在接种了B.velezensis的根中，生长素反应增强（图1B和1C）。根表型取决于细菌生长素分泌，与接种了生长素产生缺陷的B.velezensis菌株的植物一样（△ysnE（Idris et al.，2007），见图S1C），生长素产生缺陷的B.velezensis菌株（△ysnE）未表现出初生根生长（△ysnE抑制或侧根刺激（图1A、S1A和S1B），并降低了DR5:：GFP荧光（图1B和1C）。
△ysnE细菌未能像WT细菌一样有效地定殖根，这表明细菌生长素不仅触发根发育反应，而且对有效的根定殖也是必要的（图1D-1F）。△YsnE的反式互补（△ysnE；amyE:：PysnEYsnE）恢复了生长素的产生（图S1C）和根定殖（图1D）。同样，外源生长素（IAA）的添加也恢复了△ysnE细菌的定植（图1D）。在生长素生物合成途径中的另外两个突变体△trpAB和△trpED中获得了类似的结果（Idris等人，2007年）（图1D）。DysnE细菌在体外表现出正常生长（图S1D），正常群集运动（图S1E）和生物膜形成（图S1F），表明这些过程可能影响根系定殖（Chen等人，2013；Ditel等人，2013），与定殖能力降低无关。为了阐明根本原因，我们对表达WT和△ysnE GFP的细菌的根定殖进行了延时显微镜观察（Fan等人，2011）。尽管大多数WT细菌在根上复制并形成菌落（图1G），△ysnE细菌未能复制（图1H）。我们得出结论，细菌生长素是B.velezensis在根上生存和复制所必需的。
图1 细菌生长素促进植物侧生根形成和细菌根系定植
（A） 幼苗在琼脂平板上接种WT、△ysnE细菌或缓冲液（模拟）7天，并计算侧根数。（n≥20）（*p<0.05，方差分析后为事后Tukey-Kramer）；
（B和C）将拟南芥DR5:：GFP报告系与指示菌株在琼脂平板上接种48小时。（B） 1003来自DR5:：GFP表达的GFP荧光的最大投影共焦图像。（C） 从最大强度投影图像定量GFP荧光。所示为平均值和标准差n=5，每个圆圈代表一个根。（***p<0.005，双尾t检验加Bonferroni校正）标尺，50 mm；
（D） 幼苗在琼脂平板上接种带有或不带有5 mM IAA（对于△ysnE细菌）的指定菌株48小时，并计算定植细菌的数量。所示为平均值和SD（log10转化）；每个圆圈代表来自同一根的3个技术复制的平均值，（ ***p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（E和F）用表达GFP（amyE:：Pspac-gfp）的WT或△ysnE细菌在琼脂平板上接种幼苗48小时。所示为200X WT（E）和DysnE（F）细菌根部DIC（差异干涉对比度）和细菌GFP荧光的最大投影共焦图像（左面板）。标尺，50 mm。
（G和H）用表达GFP（amyE:：Pspac-gfp）的WT（G）或△ysnE（H）细菌接种幼苗，然后用延时共焦显微镜观察12小时。所示为400X 最大投影重叠图像，分别是来自根的DIC（灰色）和来自细菌的GFP荧光（绿色），在指定的时间点拍摄。黄色箭头突出显示细菌生长停滞，可能导致细胞死亡。红色箭头突出显示远离根平面复制的△ysnE细菌。刻度条，10 mm。
图S1细菌生长素对植物根系和细菌生理的影响。与图1相关
（A）幼苗在琼脂平板上接种WT、△ysnE细菌或缓冲液（mock）7天。所示为每种试验条件下的代表性板材。
（B） 幼苗在琼脂平板上接种WT、△ysnE细菌或单独缓冲液（mock）7天，并测量初生根长度，n≥ 20每个圆代表一个根。（ ***=P<0.005，采用Bonferoni校正的双尾t检验）。
（C） 指示的菌株在23°的朗迪培养基中以低摇动（25 RPM）培养72小时，并使用Salkowski法测量IAA浓度。所示为平均值和标准差，n=3。每个圆圈代表一种类中3次技术重复的平均值。（ *=P<0.05，采用Bonferoni校正的双尾t检验）。
（D） 在23°下培养WT或△ysnE细菌，并测量OD600。所示为平均值和标准差，n=3。
（e）将WT或△ysnE细菌接种于0.7%琼脂平板中部，在37°培养18℃。高分辨率分光计。所示为每种基因型3个板的代表性板。
（F） 将WT或△ysnE细菌接种到6孔板中的MSgg培养基中，并在23°下培养96小时。所示为每个基因型的3个代表性样格。
【2.生长素是对抗植物免疫反应所必需的】
△ysnE细菌在根部定殖能力的降低（图1H）导致我们假设B.velezensis能够触发植物免疫反应（另见Xie et al.，2017）。此前已证明，病原菌产生的生长素会降低植物免疫反应（McClerklin et al.，2018）.细菌定植48小时后对整个根系进行RNA测序，与缓冲液接种根系（mock）相比，与免疫系统激活相关的基因类别，如camalexin合成和胼胝质沉积，在根系转录组中富集（图2A）这些早期反应结果通过免疫相关启动子（pPER5，pFRK1）与荧光报告子融合的表达增加（Zhou等人，2020年）（图2B和2C）以及胼胝质沉积（图S2A和S2B）得到证实，表明B.velezensis定植引起免疫反应。监测植物活性氧的产生也显示出显著的反应（图2D）。
为了确定触发免疫反应的途径，我们测量了三种不同MAMP受体缺失的植物中的ROS反应—fls2：细菌鞭毛受体的突变体（Zipfel等人，2004年），efr2：细菌延伸因子TU受体的突变体（Zipfel等人，2006年），以及细菌肽聚糖受体中的突变体lym1、lym3（Willmann等人，2011）。我们发现efr2和fls2的活性氧生成量显著减少（图2B）。这些结果与elf18和flg22及其各自在velezensis双歧杆菌基因组表位之间的相似性一致（分别为70.6%和66.7%，图S2C）。efr2也显示胼胝质沉积减少（图S2A）我们假设，如果细菌生长素是对抗植物免疫应答所必需的，那么生长素产生缺陷的细菌在免疫力低下的突变植物上的定殖就会恢复。根据这一假设，我们发现在efr2突变植物上△ysnE生长显著增强（图2E、3A、3B和S2D），但有趣的是，在fls2植物上没有。尽管这些生长素缺陷细菌能够在efr2突变植物上复制，但与野生型细菌不同，它们不粘附在根上（比较图3A、3B和1G）。EFR受体在根中的表达水平非常低（图3C）（Wu等人，2016；Zhou等人，2020）。然而，B.velezensis的定植高度刺激了pEFR转录报告基因的表达（图3C）。有趣的是，外源IAA也刺激了pEFR报告基因的表达（图3C）这表明细菌生长素也能够刺激EFR的表达。我们得出结论，EFR限制了△ysnE细菌的生长，生长素能够克服这种限制。
图2. B.velezensis以EFR依赖的方式触发免疫反应
（A）响应B.velezensis定植而上调的植物基因的代表性生物过程GO富集分析。p<0.05。
（B和C）将指定基因型的幼苗单独接种细菌或缓冲液（mock）48小时。所示为400X的pUBQ10:：RCI2A TD番茄（红色）和pPER5:：NLS3xMinus（绿色）（B）或pFRK1:：NLS-3xmVENUS（绿色）（C）的重叠图像。每种条件下的五根代表根。比例尺，25 mm。
（D）将取自所示植物基因型的28天龄植物的叶盘与调整至OD 0.1的细菌孵育，并测量ROS爆发。所示为平均值和SD（n ≥10）。efr和fls2在较小程度上表现出ROS反应的显著降低（p<0.05，ANOVA随后是Tukey-Kramer 检验）。
（E） 将所示基因型的幼苗在琼脂平板上接种WT或△ysnE细菌48小时，并计算定植细菌的数量。所示为2个独立实验（log10转化）的平均值和SD，每个实验n=3，每个圆圈代表来自同一根的3个技术复制的平均值，（ ***p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
图S2。细菌以EFR依赖的方式在根部诱导免疫反应。相关的如图2所示。
（A-B）将Col-0或efr2的幼苗单独接种细菌或缓冲液（mock）48小时，然后用乙醇过夜清除，并用苯胺蓝染料染色。所示为200倍共聚焦DAPI图像（C）和胼胝质沉积数量量化的平均值和标准差（D）。N≥ 4.每个圆代表一个根。（*=P<0.05，双尾t检验）。比例尺25µm。
（C） Blast2seq分析elf18和flg22肽与相应的巴氏杆菌蛋白、Tuf和Hag。
（D） 来自指定基因型的幼苗在琼脂平板上接种表达GFP的指定菌株48小时。显示的是来自根部的200倍最大投影共焦图像（左面板）和来自细菌的GFP荧光（右面板）。比例尺50µm。
图3.细菌生长素对抗植物免疫反应
（A和B）用表达GFP（amyE:：Pspac GFP）的WT（A）或△ysnE细菌（B）接种幼苗，然后用延时共焦显微镜观察12小时。所示为400X来自根的DIC重叠图像（灰色）和来自细菌的GFP荧光（绿色），在指定的时间点采集。△ysnE细菌在根上复制，但未能以类似于WT细菌的方式粘附（也与图1G比较）。比例尺，10 mm。
（C）pEFR:：NLS-3xmVENUS，pUBQ10:：RCI2A td Tomato的幼苗接种WT细菌，在5 mM IAA或缓冲液中生长48小时。所示为每种条件下5根pUBQ10:：RCI2A tdTomato（细胞壁，红色）和pEFR:：NLS-3xmVENUS（EFR表达细胞，绿色）的400X代表性重叠图像。比例尺，20 mM。
（D）将所示基因型的幼苗在琼脂平板上接种WT或△ysnE细菌48小时，并计算定植细菌的数量。所示为至少两个独立重复的平均值和SD（log10转化），每个n=3，每个圆圈代表来自同一根的3个技术复制品的平均值。（***p<0.005，双尾t检验加Bonferroni校正）。
【3.生长素拮抗活性氧毒性】
为了确定受细菌生长素干扰的植物免疫成分，我们监测了△ysnE细菌在免疫应答基因突变体上的定植，SALK_068675(一个额外的efr突变等位基因)的突变恢复了△ysnE细菌定植。此外，一个在多个MAMP受体活化方面存在缺陷的bak1-5突变体，以及EFR受体功能所必需的基因crt3突变体(Li et al.， 2009)也恢复△ysnE细菌定殖(图S3A)。吲哚葡萄糖苷和植保素合成途径的干扰(myb51， Frerigmann et al.， 2014和cyp71a13, Mucha et al.， 2019)和植物胁迫激素效应因子(npr1-5, ein2-5, jar1-1)的缺陷都没有影响△ysnE细菌定植(图S3A)。值得注意的是SA反应缺乏(npr1-5 Ding and Ding, 2020)，因为已知生长素与SA途径拮抗相互作用，以增强P.syringae的定植(mclklin et al.，2018;Robert-Seilaniantz et al . ,2011）. 相比之下，生长素缺乏细菌的生长被恢复为免疫触发ROS产生缺陷(图3D) (Torres et al.， 2005)。此外，当DPI化学抑制ROS的产生时，△ysnE细菌定殖得到显著恢复(Tsukagoshi等人，2010)(图S3B)。这些结果表明，细菌生长素拮抗植物ROS的产生，使根系定植。
在rbohd rbohf植物上，B.velezensis造成负面影响，显著增加了根系定殖（图3D），减少了侧根和较小植物的数量（图S3C和S3D）.我们假设efr2植物，尽管在B.velezensis触发的免疫中受到干扰，仍然能够通过产生ROS引发足够强的免疫反应（图2B）防止细菌在植物中过度生长。ROS是植物利用的有毒分子，用于杀死入侵的病原体，并向感染部位附近的细胞发出信号，以诱导防御途径（例如Fones和Preston，2012）。NADPH氧化酶，如RbohD和RbohF，产生超氧物（O2）离子，可进一步转化为其他活性氧，如H2O2（Wang et al.，2018）。O2在体外对B.velezensis具有高度毒性（图4A），而H2O2仅在高浓度（500mM）下杀死细菌（图S3E）。与生长素缺陷细菌相比，O2对野生型细菌的毒性显著降低（图4A）外源性IAA提高了两种细菌的存活率（图4A）。这些结果表明，生长素使细菌能够在活性氧的毒性作用下存活。
为了更深入地了解生长素对细菌与活性氧相互作用的影响，我们检测了添加O2后培养物中WT和△ysnE细菌的整体基因表达变化。在WT细菌中，371个基因上调，374个基因下调（图4B），而△ysnE细菌表现出较弱的反应（图4B和4C），只有153个基因上调，184个基因下调（图4B）。WT细菌中上调基因的富集GO类别包括SOS反应和DNA修复，而△ysnE中缺少DNA修复类别（图4D）。katA和ahpF基因对ROS解毒很重要（Engelmann和Hecker，1996；Poole，2005），recA基因对DNA修复很重要（Alonso等人，2013）。所有三种都在活性氧处理后上调（表S3，所有三种都在WT细菌中更大程度地被诱导）。在IPTG诱导启动子下，这些基因在△ysnE细菌中的表达显著增强了根定植（图4E）。有趣的是，与铁稳态相关的GO类别在WT细菌的转录组中富集，但在△ysnE细菌中不富集（图4D和表S4）。已知亚铁(Fe 2+)与过氧化氢在Fenton反应中相互作用，产生有毒的羟基自由基(Cornelis等人，2011年)，可能会放大短暂生存的o2分子的毒性。因此，铁隔离可以保护细胞免受活性氧的毒性作用。在IPTG诱导的启动子下，△ysnE细菌中铁载体杆菌素或血红素合成操纵子的表达增强了它们在根部的定殖能力（图S4A）。将MS培养基中的铁含量降低50%也可改善△ysnE细菌的根系定殖（图S4B）。值得注意的是，生长素能够在体外保护B.velezensis免受铁毒性（图S4C和S4D）。WT细菌中显著缺失的基因类别包括TCA循环、碳水化合物和氨基酸转运，尽管△ysnE细菌中这些类别均未缺失。我们推测WT细菌进入生长停滞期可以保护它们免受ROS毒性，而不能诱导生长停滞的△ysnE细菌则被杀死。因此，我们的研究结果确定ROS是根定植过程中的主要限制因子，生长素是减轻ROS毒性的关键细菌效应因子。向不含ROS的细菌中添加IAA对转录的影响可以忽略不计，这表明仅生长素不足以解释这些转录变化，并且在胁迫期间诱导的其他因素对于生长素发挥作用是必要的。
鉴于我们发现生长素在降低ROS毒性中起主要作用，我们假设ROS暴露会导致细菌中生长素的积累。为了验证这一假设，我们使用了YsnEtoGFP，并观察到它在体外累积的前列腺治疗（图S4E和S4F）。我们从经ROS处理的细菌培养物中收集上清液，并将其应用于表达DR5:：GFP的植物，与经△ysnE细菌或未经处理的WT细菌上清液处理的植物相比，这导致DR5:：GFP荧光更大增加（图4F）。与这些结果一致，细菌感染的efr2根系定植不能表现出侧向根刺激，且具有正常的原根长度(图4G和S4G)。此外，携带DR5::GFP的efr2植株的细菌定殖后，其GFP的表达量明显低于DR5::GFP的WT植株(图4H)，这表明EFR诱导植物产生ROS是触发细菌生长素高效生产的必要条件。
图S3 细菌生长素增加对植物免疫系统反应的细菌存活。与图3相关
（A） 将所示基因型的幼苗在琼脂平板上接种WT或D细菌48小时，并计数定植细菌的数量。所示为平均值和SD（对数10转换），n≥ 3.每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ *** =P<0.005，双尾t检验）。
（B） 幼苗在含有5µM DPI的琼脂平板上接种WT或D 48小时，并计数定植细菌的数量。所示为2个独立实验的平均值和标准差，n=3。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ * =P<0.05，双尾t检验）。
（C-D）用细菌或缓冲液（mock）在琼脂平板上接种rbohd-rbohf植物幼苗7天，并计算侧根数。所示为平均值和标准差（n≥ 20） （C）和代表性板（D）。（ *** =P<0.005，双尾t检验）。
（E）生长至OD 600=1的细菌培养物用指定浓度的H2O2处理30分钟，并计数CFU。所示为平均值和标准差（对数10转换），n=3。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ * =P<0.05，双尾t检验加Bonferoni校正）。
（F）生长至OD 600=1的细菌培养物通过与黄嘌呤和5µL黄嘌呤氧化酶（类似于图3A）或0.5µL黄嘌呤氧化酶（用于RNA测序实验的浓度，图3C）的酶反应用O-处理30分钟，并计数CFU。所示为平均值和标准差（对数10转换），n=3。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。
图4. 细菌生长素对抗活性氧毒性
（A） 生长至OD 600=1的细菌培养物在存在或不存在5 mM IAA的情况下用O2处理30分钟，并计数CFU。所示为平均值和SD（对数10转换）n=3。每个圆圈代表来自同一类型的平均3个技术复制品。（ * p<0.05，*** p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（B） 维恩图显示了显著受影响的基因。左边是氧气处理后消耗的基因，右边是氧气处理后富集的基因。
（C） 对以亚致死浓度（见图S3F）氧气处理30分钟或仅以底物作为对照的WT或△ysnE细菌的RNA序列进行主成分分析。
（D） 代表性生物过程是对O2处理后上调基因的GO term分析。p<0.05。
（E） 在含有0.5 mM IPTG（+IPTG）或不含IPTG（IPTG）的平板上将指示菌株接种幼苗48 h，并计数定植细菌的数量。所示为2个独立实验的平均值和SD（log10转换），每个实验的n R 3，每个圆圈代表来自同一根的3个技术复制品的平均值。（ ** p<0.01，双尾t检验）。
（F） 将拟南芥DR5:：GFP报告株系与生长至OD 600=1的WT或△ysnE细菌衍生培养基接种12小时，并用O2处理30分钟。所示为DR5:：GFP（nR 5）荧光强度的平均值和SD，每个圆圈代表一个根。（ *** p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（G） 用细菌或缓冲液（mock）在琼脂平板上接种Col-0或efr2植物幼苗7天，并计数侧根数。（n≥ 20）（ * p<0.05，方差分析后用Tukey-Kramer检验）。
（H） 拟南芥DR5:：GFP报告系和efr2；将DR5:：GFP与指示菌株在琼脂平板上接种48小时，并根据最大强度投影图像定量GFP荧光。所示为平均值和SD n=5，每个圆代表一个根。（ * p<0.05，*** p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
图S4 ROS诱导基因对植物免疫系统反应的宿主存活具有重要意义。与图4相关。
（A） 幼苗在有无0.5mM的条件下接种指定菌株48小时的IPTG和细菌CFU计数。所示为2个独立实验的平均值和SD（log10转换），n≥ 3.每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ *** =P<0.01， *** =P<0.005，双尾t检验）。
（B） 在0.5 MS无铁琼脂平板上接种WT或D细菌48小时，补充27.8 mg/l硫酸亚铁（全铁）或该量的一半，并计算定植细菌的数量。所示为平均值和SD（对数10转换），n≥ 3.每个圆圈代表平均3次技术重复。（ * =P<0.05，双尾t检验）。
（C-D）所示菌株在含或不含5µM IAA的LB琼脂平板上扩散。在细菌草坪上发现1M硫酸亚铁中的5µL，平板在37°下培养过夜，并测量斑点周围的生长抑制区。显示的是来自∆pfeT细菌（C），在铁外排泵中发生突变（Guan等人，2015年）。在存在（上部）或不存在（下部）5µM IAA的情况下生长。D中显示了至少6个FeSO4点的生长抑制区量化的平均值和SD。每个圆圈代表一个点。（ *** =P<0.005，双尾t检验）。比例尺0.5mm
（E-F）将生长至OD600=1的Ysne GFP表达细菌用O-处理30分钟并在显微镜下观察。所示为400倍DIC图像（左）和来自YsnE（右）（E）的GFP荧光，以及GFP（F）的定量。用不含酶的底物（Mock）处理的细菌作为对照。比例尺3µm。（GFP暴露时间=520 ms）。
（G） Col-0或efr2的幼苗在琼脂平板上接种细菌或单独缓冲液（mock）7天，并测量初生根长度，n≥ 20每个圆代表一个根。
【4.生长素促进细菌在根上的粘附和菌落形成】
尽管△ysnE细菌的生长在efr2根上得以恢复（图2E和S2C），但这些细菌与WT细菌与Col-0根的粘附方式不同（图3A）。有趣的是，当WT细菌定植efr2根时，也发生了类似的低效粘附（图5A、5B、S5A和S5B）。时间推移显微镜对根系粘附的量化显示，在12小时的实验中，平均83%的定殖WT Col-0根系的细菌仍然粘附在根系上（图5A），而在efr2根系上只有32%的细菌仍然粘附在根系上（图5A和S5A）。48小时后在根上定植的细菌的宏观结构显示Col-0根上有大簇（图5B和S5B），而在efr2根上定植的细菌则是小斑块（图5B和S5B），可能反映了相同的扰动粘附和菌落形成现象。这表明efr2根系中受到干扰的有效ROS反应对于紧密的根系粘附和菌落形成是必要的。外源IAA的添加刺激了Col-0和efr2植物的定殖（图5C）。外源IAA可刺激生长素感知受损的突变植物的根系定殖（图S5C和S5D），表明生长素至少部分影响细菌粘附根系的能力，而不是根系对细菌的反应，尽管不能排除根系反应。
为了阐明生长素促进根系粘附和扩散的机制，我们筛选了一系列与定殖相关的突变细菌，这些细菌的运动性、粘附性和生物膜形成基因受损（Chen等人，2007年），用于生长素增强定殖（图5D）。无论是否添加IAA，具有突变脂磷壁酸合酶基因△yfnI的细菌都失去了在根上定殖的能力。缺乏鞭毛器（△hag）的细菌与野生型细菌相似，在根部定居。然而，在添加IAA后，它们没有表现出更强的定殖能力（图5C和5D）。转录组分析（IAA诱导的hag基因表达logFC=0.79）和体外运动试验（图S5E）也表明了生长素诱导的鞭毛形成。△hag细菌也未能诱导侧根形成（图5E）。有趣的是，△swrA细菌（鞭毛合成的调节器）也获得了类似的结果。然而，含有完整但不可移动鞭毛的△motA细菌仍然能够对添加IAA作出反应（图S5F），这表明鞭毛的存在，而不是鞭毛的运动，是根粘附的重要因素。我们得出结论，生长素诱导的鞭毛产生能够增强侧根刺激所必需的根定殖。
图5 ROS通过刺激细菌鞭毛诱导生长素增强的根系定殖
（A） 将表达GFP的细菌（amyE:：Pspac GFP）接种Col-0或efr2幼苗，然后用延时共焦显微镜观察12小时。在t=2小时计数定植细菌的斑点，并跟踪到t=12小时。在此时间过程中保持附着的细菌被视为成功定植事件（参见图S6A中的示例）。所示为t=12h时成功定植的细菌占t=2h时定植细菌总数的百分比。结果是每个基因型至少3次延时实验的平均值和标准差。N≥ 25个点，每个点代表一个时间间隔实验。（ * p<0.05，双尾t检验）。
（B和C）用所示的表达GFP的菌株在琼脂平板上接种幼苗48小时。在没有（B）或存在5 mM IAA（C）的情况下。所示为2003年根部DIC的最大投影共焦图像（左图）和细菌的GFP荧光（右图）。刻度尺，50mm。
（D） 幼苗在琼脂平板上接种带有或不带有5 mM IAA的指示细菌菌株48小时，并计数定植细菌的数量。图中显示的是平均值和SD（log10转换），n=3，每个圆圈代表来自同一根的三个技术重复品的平均值。（*** p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（E） 幼苗在琼脂平板上接种WT orDhag细菌或单独缓冲液（mock）7天，并计算侧根数。nR 20，（ * p<0.05，方差分析后用Tukey-Kramer检验）。
图S5 ROS诱导的生长素通过刺激细菌鞭毛增强根定殖。与图5相关。
（A） 用表达GFP的细菌（amyE:：Pspac GFP）接种Col-0或efr2幼苗，然后用延时共聚焦显微镜观察12小时。在t=2小时计数定植细菌的斑点，并跟踪到t=12。在此期间保持附着的细菌被视为成功定植事件（量化见图4A）。所示为在指定时间点从efr2根获取的来自根的DIC（灰色）和来自细菌的GFP荧光（绿色）的400倍叠加图像。红色箭头突出显示已成功定植的细菌。黄色箭头突出显示了被视为未成功定植的细菌。比例尺10µm。
（B-C）将所示基因型的幼苗接种表达GFP的野生菌，在琼脂平板上培养48小时。在不存在（B）或存在5µM IAA（C）的情况下。图中显示的是来自根部的200倍最大投影共焦DIC图像（左图）和来自细菌的GFP荧光图像（右图）。比例尺50µm
（D） 将所示基因型的幼苗在存在或不存在5µM IAA的情况下在琼脂平板上接种WT细菌48小时，并计数定植细菌的数量。所示为2个独立实验（log10转换）的平均值和SD，其中n≥ 每人3个。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ *** =P<0.005，双尾t检验）。
（E）接种0.7%琼脂平板，接种5μm IAA或不接种（mock），37℃培养9h。所示为每种情况下3块板的代表性板。比例尺2毫米。（F） 幼苗在琼脂平板上接种带有或不带有5µM IAA的指示菌株48小时，并计数定植细菌的数量。图中显示的是平均值和SD（log10转换），n=3，每个圆圈代表来自同一根的3个技术重复品的平均值。（ * =P<0.05， *** =P<0.005，双尾t检验）。
【5.植物免疫系统通过多种细菌刺激根系定植和生长素分泌】
为了确定细菌生长素分泌和植物免疫是否以类似的方式与其他细菌相互作用，我们分析了多粘拟杆菌（P.polymyxa）的定殖能力，这是一种已知能分泌大量生长素并刺激植物生长的革兰氏阳性菌（Jeong et al.，2011）。多粘菌刺激侧根形成，缩短初生根，并在琼脂平板上的根中表达DR5:：GFP（图6A-6C）。多粘菌也以FLS2依赖的方式刺激植物活性氧的产生（图6D）。在fls2植物上，尽管细菌在fls2植物上达到更高的CFU（图6E），但多粘菌不能刺激侧根的产生（图6B），与Col-0相比，多粘菌的初生根更长，这表明免疫系统的激活和ROS的产生是细菌生长素产生所必需的。此外，外源IAA刺激多粘菌的根定殖（图6F）。最后，IAA诱导FLS启动子表达（图6G）。因此，多粘菌产生的生长素与植物免疫相互作用，尽管受到不同于B.velezensis的免疫受体的调节。节杆菌MF161是从拟南芥根中分离的另一种革兰氏阳性生长素分泌细菌（Levy等人，2017年）。该菌株的接种刺激侧根形成和DR5:：GFP表达（图S6A和S6B），并以FLS2依赖的方式触发免疫反应（图S6C）。节杆菌MF161未能促进侧根的形成，并且在fls2植物上具有较长的初生根（图S6b和S6D）。在Col-0和fls2植物之间观察到了无差异根克隆（图S6E）。最后，外源IAA进一步刺激了该菌株的根定植（图S6F）。生长素没有刺激分泌生长素的假单胞菌65（Kamilova等人，2006年）和WCS374（Zamioudis等人，2013年）（图S6G）的根定殖，这表明生长素刺激的定植不是一种普遍现象，而是细菌特异性的。
我们的结果表明，植物免疫系统产生的活性氧对于有效的根系粘附是必要的。然而，这种现象并没有表现在细菌负荷的差异上（图5）。鉴于自然界中的细菌与许多其他物种竞争，以栖息在同一植物根系生态位（Bai等人，2015；Lundberg等人，2012），我们假设，在与其他细菌竞争期间，B.velezensis根系粘附能力的差异将变得明显。为了验证这一假设，我们在Col-0和efr2植物上共接种了多粘菌和B.velezensis。多粘菌的定植仅受FLS受体调节，而不受EFR调节（图6D），而B.velezensis的定植主要受EFR受体调节（图2D）。共同接种后，B.velezensis在Col-0上与多粘菌竞争（图6H）。然而，在efr2植物上，我们观察到多粘菌定植显著增加，而共存的B.velezensis定殖的减少（图6H）。在Col0和efr2植物上接种B.velezensis 48小时，然后转移到非无菌土壤中，也表现出同样的效果，Col-0植物定植增强（图6I），表明免疫调节有助于细菌与土壤微生物群竞争。在Col-0和efr2植物上共同接种B.velezensis和节杆菌MF161，对这两种细菌均无显著影响（图S7A）。对定殖点的检查显示，B.velezensis和多粘菌在根的伸长和成熟区大量定植（图S7B1和S7B2），而节杆菌MF161在这些区域基本上不存在，并在根的分化部分定植（图S7B3和S7B4）。因此，我们的结果表明，免疫系统增强的定植影响了B.velezensis和多粘菌的竞争，因为它们都竞争相同的生态位，而不影响B.velezensis和节杆菌MF61的竞争，因为它们定植于不同的生态位。先前已对节杆菌MF161在34个细菌合成群落中的根定殖进行了表征（Castrillo等人，2017年；Teixeira等人，2021年）。为了探索FLS对节杆菌MF161的免疫调节影响其在群落内根定植的可能性，我们对定植Col-0或fls2的34个细菌群落进行了16S RNA测序，。然而，结果没有定论（图S7C），表明社区环境对节杆菌定植很重要。
B.velezensis产生次级代谢物，可抑制植物真菌病原体的生长（Fan等人，2018年）。我们询问植物免疫系统的激活是否能增强其抑制植物病原菌感染的能力，从而触发B.velezensis菌落的形成。我们在Col-0和efr2植物上定植了B.velezensis，并用真菌病原体立枯病丝核菌（Rhizoctonia solani）感染了这些植物（Dean等人，2012年）。B.velezensis在体外抑制R.solani的生长（图7A），并能够保护植物免受真菌感染（图7B）（Chowdhury等人，2013）。值得注意的是，通过植物重量测量，Col-0植物的植物保护效果明显更好，尽管efr2本身对真菌感染没有影响（图7C R.solani）。与efr2植物相比，监测真菌负载显示Col-0植物显著减少（图7D）。EFR激活可调节B.velezensis菌落形成，但也可通过诱导系统抗性（ISR）提高植物存活率（Pieterse等人，2014年）。为了进一步区分这些影响，我们测量了Dhag B.velezensis的植物保护作用（图7C）。△hag细菌未能保护幼苗免受R.solani感染（图7C），尽管在植物中诱导了免疫反应，类似于WT细菌（图7E）。因此，我们得出结论，在具有免疫能力的植物上增强的B.velezensis菌落形成使其能够更好地保护植物免受真菌感染。
图6 多粘菌细菌生长素分泌与植物免疫的相互作用
（A） 将拟南芥DR5:：GFP报告系在琼脂平板上接种多粘菌96小时。显示了来自DR5:：GFP报告系的1003个GFP荧光最大投影共焦图像。
（B） Col-0或fls2幼苗在琼脂平板上接种多粘菌或缓冲液（mock）7天，并计数侧根数，n=20。（ * p<0.05，方差分析后用Tukey-Kramer检验）。
（C） Col-0或fls2幼苗在琼脂平板上接种多粘菌或单独缓冲液（mock）7天，并测量初生根长度，n≥20。每个圆代表一个根。（ *** p<0.005，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（D） 将取自所示植物基因型的28天龄植物的叶盘与调整至OD 0.1的细菌孵育，并测量ROS爆发。所示为平均值和标准差，n≥10。
（E） 将Col-0或fls2幼苗在琼脂平板上接种多粘菌48小时，并计数定植细菌的数量。所示为两个独立复制（log10转化）的平均值和标准差，每个n=3。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ *** p<0.005，双尾t检验）。
（F） 用多粘菌在有或没有5 mM IAA的琼脂平板上接种幼苗48 h，并计数定植细菌的数量。所示为2个独立复制（log10转换）的平均值和SD，每个n=3。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ *** p<0.005，双尾t检验）。
（G） 用WT细菌接种pFLS:：NLS-3xmVENUS、pUBQ10:：RCI2A TD番茄幼苗，在5 mM IAA或缓冲液中培养48小时。所示为每种情况下五根植物的4003张pUBQ10:：RCI2A TD tomato（细胞壁，红色）和pFLS:：NLS-3xmVENUS（FLS表达细胞，绿色）的代表性重叠图像。比例尺，25毫米。
（H） 在琼脂平板上单独（单培养）或混合（1:1比例，共培养）接种多粘菌或velezensis双歧杆菌48小时，并计算每个菌株的定植细菌数量。所示为2个独立复制（log10转换）的平均值和SD，每个n=3。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ * p<0.05，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（一） Col-0或efr2幼苗在琼脂平板上接种B.velezensis48小时，然后将幼苗转移到非无菌盆栽土壤中7天，并计数B.velezensis的定殖数量。所示为平均值和SD（对数10转换），n=8。每个圆圈代表来自同一根的3个技术重复的平均值。（*** p<0.005，双尾t检验）。
图S6. 节杆菌Mf16中植物免疫与细菌生长素分泌的相互作用。与图6相关
（A） 用节杆菌Mf161或单独的缓冲液（mock）在琼脂平板上接种拟南芥DR5:：GFP报告系48h。显示的是来自DR5:：GFP reporter的GFP荧光的100倍最大投影共焦图像。比例尺50µm。
（B） Col-0或fls2幼苗在琼脂平板上接种节杆菌Mf161或单独缓冲液（mock）7天，并计数侧根数，n≥ 20（ * =P<0.05，方差分析后Tukey-Kramer检验）。
（C） 将取自所示基因型的28天龄植物的叶盘与调整至OD 0.1的细菌孵育，并测量ROS产生。所示为平均值和标准差（n≥ 10).
（D） Col-0或fls2幼苗在琼脂平板上接种节杆菌Mf161或单独缓冲液（mock）7天，并测量初生根的长度。（n）≥ 20). 每个圆代表一个根。（ *** =P<0.005. * =P<0.05，双尾t检验加Bonferoni校正）。
（E） Col-0或fls2幼苗在琼脂平板上接种多粘菌48h，并计数定植细菌的数量。所示为n=3的2个独立复制（log10转化）的平均值和SD。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。
（F） 幼苗与多粘菌在琼脂平板上培养48h，有无5µM IAA计算定植细菌的数量。所示为n=3的2个独立复制（log10转化）的平均值和SD。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。（ *** =P<0.005，双尾t检验）。
（G） 幼苗与荧光假单胞菌WCS365或防御假单胞菌WCS374在存在或不存在5µM IAA的琼脂平板上孵育48h，并计数定植细菌的数量。所示为平均值和标准差（对数10转换），n=4。每次治疗。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。
图S7. 面对竞争时免疫系统激活可增强细菌定植。与图6相关
（A） Col-0或efr2的幼苗在琼脂平板上单独接种节杆菌Mf161或巴氏杆菌（单一培养）或混合接种（1:1比例，共培养）48h，并计算每个菌株的定植细菌数量。所示为n=3的2个独立复制（log10转化）的平均值和SD。每个圆圈代表来自同一根的平均3次技术重复。
（B） 幼苗在琼脂平板上接种指示菌株48h。所示为400倍共聚焦DIC图像，这些DIC来自于与巴氏杆菌（1）、多粘菌（2）和关节杆菌Mf161（3-4）一起培养的根。左侧的图像是右侧图像上黑色边框的放大图，其中可以看到棒状巴氏杆菌（1）和多粘菌（2）以及关节杆菌Mf161（4）的小棒状/球菌状。黄色箭头突出显示根部延伸区的小细胞。红色箭头突出显示了根分化部分的成毛细胞的根毛。比例尺10µm。
（C） Col-0或fls2的幼苗在琼脂平板上接种34种细菌（Teixeira et al.，2021），包括节杆菌Mf161，为期7天，并通过16S RNA测序测定细菌丰度。图中所示为2个独立实验每个实验n≥ 6。每个圆代表一个根。实验中左侧面板的相对丰度差异具有统计学意义（P<0.005），但右侧面板的相对丰度差异不显著。
图7 B.velezensis对免疫系统的调节增强了植物对真菌感染的保护作用**
（A） 在PDA平板上发现了B.velezensis和R.solani，并允许其生长72小时。所示为3块板中的代表性板。
（B） 6日龄幼苗在琼脂平板上接种B.velezensis或缓冲液48小时。然后，用R.solani接种平板，并再培养7天。未经处理的植物作为对照。所示为每次处理至少5块板的代表性板。
（C） 将WT或△hag（仅Col-0）B.velezensis或缓冲液接种Col-0或efr2幼苗48小时于琼脂平板上。然后，用R.solani接种培养皿，再培养7天，并测量植株重量。未经处理的植物（既不是细菌也不是真菌）被用作对照。所示为平均值和标准差，n≥ 20。（ * p<0.05，采用Bonferroni校正的双尾t检验）。
（D） 6日龄幼苗在琼脂平板上接种B.velezensis或缓冲液48小时。然后，用R.solani接种平板，并再培养3天。3天后，彻底清洗幼苗并将其转移到新的培养皿中，24小时后在显微镜下计数附着菌丝的数量。对照植物完全被真菌覆盖，无法进行详细的量化。（ *** p<0.005双尾t检验）。
（E） pPER5:：NLS-3xmVENUS，pUBQ10:：RCI2A TDT番茄幼苗接种WT或△hag B.velezensis或单独使用缓冲液（mock）48小时。所示为每种条件下5根植物的4003张pUBQ10:：RCI2ATD番茄（红色）和pPER5:：NLS-3xmVENUS（绿色）重叠图像。比例尺，25mm。
【材料】
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