5+单基因肿瘤+自噬+细胞凋亡+单细胞+实验

今天给同学们分享一篇单基因肿瘤+自噬+细胞凋亡+单细胞+实验的生信文章“Autophagy-related gene LAPTM4B promotes the progression of renal clear cell carcinoma and is associated with immunity”，这篇文章于2023年3月2日发表在Front Pharmacol期刊上，影响因子为5.6。

肾细胞癌（RCC）是一种常见的泌尿系统疾病。目前，手术是肾癌的主要治疗方法；免疫疗法并没有像预期那样有效。因此，了解肿瘤免疫微环境（TME）中的机制，并探索新的免疫治疗靶点被认为是重要的。最近的研究表明，自噬可以影响肾细胞癌的免疫环境，并诱导癌细胞的增殖和凋亡。

1. LAPTM4B在ccRCC组织中的表达和预后价值

从KEGG数据库和已发表的文献中获取了溶酶体基因集（121个基因）和自噬基因集（36个基因）。为了比较溶酶体和自噬基因，作者获取了共同的基因LAPTM4B（图1A）。作者基于TCGA的534名患者分析了LAPTM4B表达水平和生存率之间的相关性，并发现LAPTM4B表达水平低的患者比表达水平高的患者有更好的总体生存率（图1B）。

图1 LAPTM4B的表达及其在ccRCC组织中的预后价值

据证实，肿瘤组织中LAPTM4B的表达高于正常组织。在本研究中，使用尿液存活素方法检测LAPTM4B含量，并用其构建了一个肾细胞癌的诊断模型，AUC为0.920。然而，在本研究中并未进一步讨论LAPTM4B在ccRCC中的具体机制，尽管这是作者研究的补偿和研究重点。为了探索LAPTM4B在不同级别的ccRCC中的表达情况，基于免疫印迹法，分析了10名患者（Fuhrman III/IV：3名患者，Fuhrman I/II：7名患者）的ccRCC组织和相配的正常肾组织中LAPTM4B的蛋白水平。有趣的是，结果表明，Fuhrman III/IV级ccRCC组织中LAPTM4B的蛋白水平高于相配的正常肾组织（图1C）。相比之下，Fuhrman I/II级ccRCC组织中LAPTM4B的蛋白水平低于相配的正常肾组织。

2. 功能富集

功能富集结果显示，差异表达基因（DEGs）可以参与细胞增殖和死亡相关的通信，并调节免疫相关和检查点PD-L1相关的途径（图2）。根据GSEA分析结果，DEGs可以参与细胞增殖、死亡、细胞周期等途径（图3A、B）。为了进一步比较两组之间细胞信号通路活性的差异，基因集GSVA结果显示，与癌细胞增殖和分裂相关的TNFA-NKFB、JAK-STAT3、P53等途径显著增加（图4C）。KEGG-GSVA富集结果也证实，与癌细胞增殖和转移相关的途径在高组中，如细胞周期、mTOR、VEGF和JAK-STAT信号通路，显著增加（图4D）。

图2 GO/KEGG功能富集的差异表达基因（DEGs）

图3 GSEA功能富集分析差异表达基因（DEGs）和GSVA功能富集分析两组

图4 对534个TCGA肿瘤样本的免疫细胞矩阵和丰度进行评估

3. 免疫浸润和检查点的定量评估

基于ssGSEA免疫矩阵算法，作者观察到高LAPTM4B表达组和低LAPTM4B表达组之间的免疫微环境评分差异。高组肿瘤组织的基质评分高于低组（p < 0.001）。高组肿瘤组织的免疫评分环境较其他肿瘤组织更差（p < 0.001）。然而，两组之间的估计评分和肿瘤纯度没有显著差异（图4A）。为了进一步探索两组之间特定的免疫细胞差异，作者使用估计算法评估了两组的免疫成分。图4B、C显示了两组中22个免疫细胞的成分和比例。两组之间的比较（图4D）显示出免疫细胞之间的显著差异，低组中的CD8 T细胞显著高于高组，而与癌细胞增殖和转移相关的M2巨噬细胞在高组中显著高于低组。免疫细胞相关性研究结果显示（图4E，F），CD8 T细胞与M2巨噬细胞之间存在显著的负相关。LAPTM4B与免疫细胞之间的相关性分析显示，LAPTM与每种免疫细胞都存在相关性（图5）；LAPTM4B与与肿瘤转移相关的M2巨噬细胞呈正相关。LAPTM4B与免疫检查点基因之间的相关性分析显示，CD44与VTCN1、TNFSF15、CD276和CD44呈正相关，并具有统计学意义，而其他基因呈负相关。

图5 LAPTM4B与免疫细胞的相关性

4. 对结直肠癌单个细胞中通路活性的评估

对两个ccRCC的单细胞RNA测序样本进行了Harmony整合（图6A），并使用PCA、tSNE和UMAP方法进行降维和聚类。使用默认参数（logfc.threshold = 0.25）来识别每个聚类中的差异标记基因（图6C）。在使用SingleR算法进行注释后，获得了8种细胞类型（图6B、C）。LAPTM4B主要在干细胞、内皮细胞和上皮细胞中表达（图6D）。基于KEGG基因集的AUC活性算法结果显示，溶酶体通路在巨噬细胞和单核细胞中的活性高于其他亚群（图6E）。然而，与自噬相关的通路的活性在NK细胞、T细胞和单核细胞中相对较高（图6F）。

图6 单细胞通路活性评估

5. LAPTM4B的敲除抑制了RCC的生长

为了研究LAPTM4B在肾细胞癌中的作用，作者进行了实验，检测了LAPTM4B沉默后ccRCC细胞的增殖情况。作者转染了两种LAPTM4B表达强的细胞系（786-O和ACHN）与LAPTM4B-shRNA慢病毒。在shRNA慢病毒感染3天后，通过qRT-PCR和Western blotting实验确认了LAPTM4B的表达；结果显示，与shCtrl细胞相比，shLAPTM4B细胞中LAPTM4B的表达明显降低（图7A、B）。为了研究LAPTM4B对细胞增殖和存活的影响，作者使用Celigo图像细胞计数仪和MTT实验。结果显示，随着时间的推移，shLAPTM4B细胞中786-O和ACHN细胞的数量明显低于shCtrl细胞（图7E-H）。此外，如图7I、J所示，shLAPTM4B细胞的OD值低于shCtrl细胞。数据表明，LAPTM4B对肾癌细胞的生长有贡献。

图7 LAPTM4B在ccRCC细胞增殖中的作用

6. LAPTM4B的敲除引发了细胞凋亡

为了评估LAPTM4B是否参与了RCC的凋亡，如图8A、B所示，LAPTM4B被敲除后，两种细胞中的caspase 3/4活性显著增加（p < 0.0001），与shCtrl细胞相比。LAPTM4B的敲除导致786-O细胞中凋亡率显著增加，而shCtrl细胞中的凋亡率较低（p < 0.0001）。

图8 LAPTM4B的敲除引发细胞凋亡

总结

通过评估单个细胞中的通路活性，作者发现在所有细胞类型中，自噬活性的表达没有显著差异。相反，溶酶体活性在未成熟的巨噬细胞和单核细胞中更为明显，这可能与免疫细胞的明显效应有关。然而，LAPTM4B的表达在干细胞和内皮细胞中更为明显，但在巨噬细胞中并不明显，这也是本研究的局限之一。这种现象可能归因于作者的单细胞数据来自数据库，样本量较小，并且由于缺乏多样本验证而存在实验误差。为了克服这个局限，可以在临床实践中使用大样本测序样本来验证结果，以改进LAPTM4B在肾癌中的机制。总之，LAPTM4B是肾癌发展的不利因素。针对LAPTM4B的靶向治疗和对RCC患者的早期干预可以帮助改善他们的生存状况和生活质量。