生信分析学习笔记 - RNAseq （三） FastQC评估

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       下图为某一条RNAseq从数据预处理，序列回帖到数据可视化的工作流程，包含了较多的软件（Linux环境运行）和若干个包（R语言环境运行），本系列将按下图，对每一个步骤进行学习和理解。

某RNAseq分析流程

FastQC可以生成fastq文件的质量报告。

Basic Statistics

从read水平，概况fastq文件质量。

可从文件中获得文件名，文件类型，测试平台的版本（Encoding），总序列数，标为质量差的序列数，序列长度和GC占比。不同物种GC占比不同，人类为42%左右。

样品1

Per base sequence quality

       一种可快速分析测序质量的方法。绿色区域的值是完全正常，黄色区域为轻度不正常，红色区域为非常不正常。

       横坐标为读段，纵坐标为测序质量评估。这里的Quality score=-10*lg10(error P)，20%Q表示1%的错误读取率，30%为0.1%错误读取率。黄色块的上下线表示质量25%和75%；蓝色线，平均数；红色线，中位数。

一般要求箱线图10%的线大于Q=20。

样品1-质量好

样品2-质量差

Per tile sequence quality

纵坐标为tail的index编号。蓝色表示质量高，浅色或红色表示质量低。目的是分析是否特定tail受影响后质量低。后续可针对性去除低质量tail。

样品2-质量差

Per sequence quality scores

该图表示总体read平均Q值的分布。横坐标为Q值，纵坐标为read数。越多read的Q值集中在高分区，证明该样品质量越好。

样品1-质量好

样品2-质量差

Per base sequence content

四个碱基在读段不同位置的百分比。横坐标是测试碱基的位置，纵坐标为碱基百分比。

理论上，四种不同碱基百分比差别不大，若测试碱基前端不同碱基差别较大（AT或CG差别超过10%），此项检测质量较低。可能的原因是在测试前几个碱基时，仪器设备调整导致的偏差，可在后续数据预处理中，将其剪出。后段差别较大的原因可能是测试时的adapter没有清除干净，可在后续清除。

样品1-质量好

样品2-质量差

Per sequence GC content

该图表示GC碱基在所有序列中的分布。红色线表示待评估样品中每read的GC数，越符合理论分布，表明该样品质量越好。如果双峰，可能混有了其他物种的DNA序列。

样品1-质量好

样品2-质量差

Sequence Length Distribution

横坐标为序列长度，纵坐标为序列数。在下图中，理论上，所有序列都应该是40 bp。

样品1

Adapter Content

检测样品中adapter是否被全部去除及种类。理论上，样品中不含有adapter。从下图中，可看出本样品有adapter未全部去除，且剩余的是Illumina Universal Adapter

样品2-质量差

MultiQC可将数个fastQC结果整合到一个文件，方便查阅分析。

Adatpter & kmer

       Adapter是Illumina双端测序时，会在待测链两端加上adapter，其和flowcell上的oligo是配对的，可帮助待测序列固定在flowcell上，而primer是扩增insert部分的引物。

在Illumina双端测序中，通用的Adapter是：

Top adapter：5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 3'

Bottom adapter：5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 3'

       Kmer就是指 k 长度的序列，比如GATTC就是5-mer。Kmer content图（如下图）分析不同k-mer的短序列出现的频数。横坐标表示短序列的长度，纵坐标表示某长度的序列在总reads中的百分比。

       在分析Kmer问题时，要考虑不同序列长度观测到的出现频率与预期频率。使用图片上端的公式计算观测值与预测值的差异。其值高于5，会被认为over-represented。同时，fastQC也会给出kmer的统计报告。可得到最显著且观测值与预测值差异最大的kmer序列内容。

kmer