hello，大家好，雾霾天就适合写写东西，放松一下，今天我们来分享一下运用10X空间转录组识别免疫细胞生态位的内容，关于空间转录组识别生态位的内容，我也分享了很多了，欢迎大家多多交流，今天分享的文章在A spatial multi-omics atlas of the human lung reveals a novel immune cell survival niche,10X空间转录组运用的文章，值得一读和借鉴其中的分析方法。
文章值得注意的地方
- 单细胞和单核细胞分析出来的细胞类型比例还是有差异的
- 单细胞空间联合和单核细胞空间联合的结果差异
- 空间临近通讯
- 目标细胞生态位及细胞类型组成
Summary
单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 已定义了人肺和气道的多种不同细胞类型。在这里，研究提出了一个多组学空间肺图谱来定义新的细胞类型，将其映射回宏观和微观解剖组织环境，以定义功能性组织微环境。首先，从肺和气道的 5 个不同位置生成了单细胞和核 RNA 测序、VDJ 测序和 Visium 空间转录组学数据集。其次，定义了额外的细胞类型/状态，并在空间上绘制了新的和已知的human呼吸道细胞类型，例如肺软骨细胞、粘膜下腺 (SMG) 导管细胞、不同的周细胞和平滑肌亚型、免疫招募成纤维细胞、支气管周围和软骨膜成纤维细胞、周围神经相关成纤维细胞和Schwann细胞。最后，在 SMG 定义了 IgA 分泌浆细胞的survival niche，包括新定义的上皮 SMG-Duct 细胞以及 B 和 T 谱系免疫细胞。使用转录组数据进行细胞间相互作用分析，提出了一个建立和支持这一生态位的信号通路。总体而言，研究提供了具有多种新型细胞类型的转录和空间肺图谱，可用于研究特定的组织微环境，例如新定义的腺相关淋巴生态位 (GALN)。
Introduction
Lung disease is the third-largest cause of mortality worldwide，因此必须更好地了解定义肺功能的细胞类型。 肺的组织学定义确定了大约 45 种不同的细胞类型，从特征明确的肺上皮细胞到罕见的神经内分泌和簇状细胞，并因气管、小气道和肺泡的位置而异。 除了呼吸功能外，肺还有重要的屏障功能。 虽然肠道和鼻咽等其他黏膜屏障组织通过明确定义的黏膜相关淋巴组织 (MALT) 协调适应性免疫，但在健康人肺中尚未报道此类次级淋巴结构。
The LungMAP and Human Lung Cell Atlas consortia利用单细胞和单核 RNA 测序方面的最新技术进步，生成了许多表征小鼠和human肺细胞类型的图谱。 除了先前已知的分类外，这项工作还确定了新的细胞状态和类型，例如肺离子细胞、氘代体细胞和组织迁移性 T 辅助细胞群。 呼吸系统疾病，如哮喘、肺纤维化、慢性鼻窦炎、囊性纤维化和吸烟的影响，都在单细胞转录组水平上进行了研究。
然而，细胞类型回到组织环境的unbiased spatial mapping仍然在很大程度上缺乏，酶解程序可能导致不具有代表性的细胞类型retrieval。为了克服这些限制，研究将单细胞和单核 RNA 测序与 Visium 空间转录组学 (ST) 相结合，创建了一个包含 129,340 个细胞、63,768 个细胞核和 16 个来自human气管、支气管和实质组织切片的肺细胞图谱。描述了 77 种细胞类型和状态的转录特征，首次包括human气道软骨细胞、两种Schwann细胞、神经相关细胞、粘膜下腺 (SMG) 导管细胞以及多个血管周围、成纤维细胞和巨噬细胞subset的转录特征.深层组织分析与空间基因表达分析相结合，使我们能够在气道的 SMG 处识别出 IgA 分泌浆细胞的新免疫生态位。我们预测内皮细胞、上皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的细胞间相互作用，这些相互作用有助于建立这个生态位。 IgA 分泌在预防呼吸道感染中起着至关重要的作用，因此研究结果有助于更深入地了解包括 COVID-19 在内的各种呼吸道传染病.
Results
A multi-omic transcriptional atlas of the human lung and airway with spatial resolution
为了生成human肺和气道中细胞类型的综合表征，将单细胞和细胞核 RNAseq（scRNAseq、snRNAseq）、VDJ 测序和空间转录组学应用于深层组织样本。 从气管、第 1 或第 2 层气道 (Bronchi 2-3)、第 3 至第 4 层气道 (Bronchi 4) 中的支气管、左上方的实质中收集来自健康供体的组织块 (1-2 cm3) 叶 (UpperPar) 和左下叶 (LowerPar) 捕获深层结构，如气道中的软骨、肌肉和粘膜下腺。
- 注： Multi-omics spatial lung atlas experimental design included fresh and frozen sampling from 5 locations for single-cell (sc) RNA sequencing (RNAseq), sc VDJ-sequencing, single-nuclei (sn) RNAseq and Visium Spatial Transcriptomics (ST). Five donors (D) from the frozen samples were pooled into five reactions, each containing different locations (Loc) from donors
总共 193,108 个good quality transcriptomes被注释为转录不同的广泛细胞类型：上皮细胞（分泌细胞、基底细胞、肺泡 1 和 2 型 - AT1 和 AT2 - 肺细胞、纤毛细胞和 SMG 细胞）、免疫细胞（淋巴、髓细胞、B 细胞、根据广泛接受的标记基因，血浆、肥大细胞）、红细胞、内皮细胞（血管-VE、淋巴-LE）和基质细胞（平滑肌、成纤维细胞、间皮细胞和软骨细胞）。我们将悬浮细胞和细胞核的分析与 Visium 空间转录组学 (ST) 分析相结合，将鉴定的细胞类型映射回来自 5 个位置的 16 个组织切片的组织结构，这些组织切片被手动注释到 13 个区域。正如预期的那样，使用 Cell2location 算法将纤毛上皮细胞映射到被基底细胞包围的气道内腔，将 AT1 和 AT2 映射到肺实质。为了检查不同协议和采样位置的好处，使用泊松线性混合模型来评估这些变量对细胞类型组成的相对影响。正如预期的那样，不同的酶处理丰富了特定的细胞类型组，但对基因表达的影响很小，不到总方差的 1%。
为了证明图谱的深度和新颖性，我们首次在human肺部（ACAN、CHAD、COL9A3、HAPLN1 和 CYTL1）中转录定义了软骨细胞，并使用 Visium ST 将这些细胞映射到软骨。 软骨细胞主要是使用气管的单核测序释放的，这证明了分析的多组学、多位置人肺图谱的实用性。
总体而言，生成了一个大型 scRNAseq 和 snRNAseq 数据集，具有不同细胞谱系的广泛代表性和匹配的空间基因表达数据，允许进一步探索细胞异质性和可能的细胞间相互作用，以更好地了解肺功能。
Identification of rare fibroblasts with immune recruiting properties
肺和气道成纤维细胞的连续聚类鉴定了 11 种具有不同标记基因的细胞类型。这里注释了先前描述的肌成纤维细胞、间皮、外膜和肺泡成纤维细胞，以及多种新的和研究较少的细胞类型，这些细胞类型无法用现有的注释进行预测。虽然大多数细胞类型是从所有位置和protocol中分离出来的，但细胞类型比例存在明显差异。正如预期的那样，外膜成纤维细胞 (Fibro-adv) 在气道样本中富集，而肺泡成纤维细胞 (Fibro-alv) 被耗尽。We further observed a rare cell type recovered only from the single cells, but not from single nuclei. 这种罕见的类型表达趋化因子 CCL19 和 CCL21，在负责淋巴结中 T 细胞定位的成纤维细胞网状细胞和 GREM1、CXCL13 和 FDCSP（一种负责 B 细胞定位的滤泡树突细胞 (FDC) 标记物）中也高度表达。这些细胞用 Visium ST 和 smFISH 方法映射到支气管上的免疫细胞浸润区域，因此被注释为免疫募集成纤维细胞 (IR-纤维)。仅在一部分供体和切片中发现免疫浸润，但与有和无吸烟史的供体的预期频率一致。 IR 纤维显示来自二级和三级淋巴结构的成纤维细胞的一些特征，发现进一步支持了这种相似性，即来自human肠道 Peyer's Patches 的germinal center成纤维细胞类型的基因特征也映射到免疫浸润区域在肺 Visium ST 切片上。总之，研究描述了一个 IR 纤维群，它可能在健康支气管中的免疫细胞募集中发挥作用。
Perichondrial and peribronchial fibroblasts reveal disease associations.
接下来检查了两种富含气管的成纤维细胞群：支气管周围（PB-纤维）和软骨周围（PC-纤维）成纤维细胞。 我们首次提供具有 COL15A1 和 ENTPD1 标记的 PB 纤维的human转录组以及气道上皮周围的定位。 功能 GWAS 分析量化了细胞类型特异性基因表达和疾病相关 SNP 之间的系统关联，证明 PB 纤维与慢性阻塞性肺病 (COPD) 相关。 PB-fibro 还表达 LGR5，正如在小鼠中报道的那样，这表明在human中具有类似的间充质干细胞功能的潜力。 WNT-5A 的 COPD 相关增加下调 Lgr5，这表明 PB 纤维可以在治疗上靶向抑制 COPD 的再生衰竭，特别是在气道中.
第二种富含气道的细胞类型 PC-纤维仅在单核数据中检测到，可能是由于软骨分离困难。 细胞类型位于 Visium ST 中软骨内的软骨细胞周围，可以通过human蛋白质图谱中标记基因 COL12A1 的表达来识别。 在 PC 纤维的标记基因中，我们检测到骨发育基因 LGR4 和 LGR6。 PC-fibro 表达标准的成纤维细胞标志物，在表达与骨骼发育相关的基因方面是独一无二的，将这些细胞置于从外膜成纤维细胞到软骨细胞的轨迹中。 最后，PC-纤维标志物富含导致human骨骼异常的基因，包括在导致骨骼畸形的罕见疾病中发生突变的 FLNB 和 FGFR2。 总之，已经确定了健康人气道软骨周围的软骨膜成纤维细胞。
- 注：High resolution of lung and airway fibroblasts and their spatial location.(a) Sequential clustering reveals 11 fibroblast populations in airways and lungs on UMAP. (b) Sample collection location and processing method affect recovered cell type proportions.Cell type composition analysis with fibroblast compartment, including location, material,dissociation protocol and donor in the model. (c) Markers of immune recruiting fibroblast population (IR-fibro) overlap with T reticular and Follicular Dendritic cell markers. (d) Immune recruiting fibroblast co-localise with immune infiltrate region in the airways with Cell2location anaysis. (e) Peribronchial fibroblasts (PB-fibro) co-localise around small airway. (f) Peribronchial fibroblasts are associated with COPD with fGWAS analysis. (g) Perichondrial fibroblasts (PC-fibro) localise around the cartilage regions in the airway. (h) Scwhann cells and nerve-associated fibroblasts (NAF) co-localise with peripheral nerve bundles via smFISH method. (i) Nerve-associated cell types markers have distinct locations in the airway nerve bundles. (j) Schematic representation of the described nerve-associated populations in the peripheral nerves of the airway.
Resolution of four distinct cell types in the peripheral nerves from the airway
最后，在成纤维细胞室中，确定了气道周围神经内的四个罕见细胞cluster：myelinating Schwann细胞（NFASC、NCMAP、MBP、PRX）、non-myelinating Schwann细胞（nmScwann）（NGFR、SCN7A、CHD2、L1CAM、 NCAM1)、神经内膜神经相关成纤维细胞 (NAF) (SOX9、OSR2) 和神经外膜 NAF。这些细胞类型在周围神经中的定位通过组织中的大量 RNA-seq、Visum ST、蛋白质染色和 smFISH 显示。具体来说，分析显示了周围神经外膜 NAF 的表达，以及神经内膜 NAF 在human气道样本中神经束内的myelinating Schwann细胞的表达。这进一步证实了髓鞘形成和非髓鞘形成myelinating Schwann细胞的身份，分别在髓鞘形成和细胞粘附类别中具有标记基因集富集。该分析进一步揭示了 EVX1——一种脊髓发育中的同源盒基因——是髓鞘化myelinating Schwann细胞的潜在调节因子。其次，nmSchwann 表达了一些涉及Schwann细胞发育和维持 (SOX10) 和髓鞘形成 (ERBB3 和 LGI4) 的基因。最后，我们观察到这些人群中罕见的外周神经系统 (PNS) 疾病基因的特异性表达。因此，即使对于非常罕见的细胞类型，我们的图谱也能识别周围神经等结构内的显微解剖位置并确定疾病关联。这里描述的细胞类型存在于其他组织中；因此，这些数据可能会在肺之外产生影响。
Resolution of the vascular cell types in the systemic and pulmonary circulation
接下来专注于研究肺中的脉管系统，它包括为组织提供氧气的体循环和发生气体交换的肺循环。在我们的数据集中，我们可以通过细胞类型的分布来区分肺循环和体循环的cluster，其中肺细胞在实质中富集，全身细胞在气管中富集。我们观察到先前描述的静脉（E-Ven-syst、E-Ven-pulm）和毛细血管（Cap、Car4-Aerocyte）内皮细胞类型。此外，我们现在区分动脉内皮细胞类型（全身性 E-Art-syst 和肺 E-Art-pulm），它们在 Visium ST 上具有明显的定位，E-Art-syst 在气管中富集。平滑肌细胞包括非血管气道平滑肌细胞 (ASM)、肺血管周围细胞类型（平滑肌 SM-pulm 和周细胞 Peri-pulm）和全身血管周围细胞
（平滑肌 SM-Art-syst、周细胞 Peri-syst 和静脉血管周细胞 IR-Ven-Peri）。 ASM 的捕获主要是通过单核数据实现的，这些数据允许检测跨组织的非血管平滑肌细胞类型的可靠标记基因.
此外，气道中发现了另一种血管周围细胞类型，表达 ABCC 和 ICAM1，但不表达 CSPG4——类似于毛细血管后静脉血管周围细胞，在外周淋巴结中的免疫细胞归巢中起作用。 这种细胞类型表达已知的白细胞募集趋化因子，并与 Visium ST 支气管切片和 smFISH 显微镜中的静脉血管共定位。 因此，这些细胞被注释为免疫募集静脉血管周围细胞 (IR-Ven-Peri)。 静脉内皮和 IR-Ven-Peri 中潜在的淋巴细胞募集能力表明在气道静脉中淋巴细胞外渗中的作用，类似于外周淋巴结中的毛细血管后小静脉。
总之，我们区分了体循环和肺循环的细胞，并描述了一种新的免疫募集毛细血管后静脉周细胞 (IR-Ven-Peri)。 我们为所有这些群体提供标记基因，将这些细胞映射回组织环境，从而进一步确定体循环和肺循环中内皮细胞和血管周围细胞之间的关系
- 注：Cell types of the systemic and pulmonary circulation. (a) UMAP visualisation of scRNA-seq data from the vascular endothelia and smooth muscle compartments. Color of dots shows cell type or location. Color of text reflects novelty. (b) E-Art-syst co-localises with arterial vessel and SM-Art-syst in the airway. (c) Marker genes of the smooth muscle compartment. (d) Enrichment of cell types shows preferential localisation to the airways versus parenchyma and cells versus nuclei. (e) IR-Ven-peri expresses immune recruiting chemokines and cell-cell adhesion molecules. (f) E-Ven-sys and IR-Ven-Peri co-localise at a venous vessel in the airway. (g) IR-Ven-Peri markers localise adjacent to the venous vessel marker in the airway. (h) Resolution of transcriptionally defined vascular cells in the systemic and pulmonary circulations.
Identification of duct and myoepithelial cells of the human airway submucosal glands (SMG)
对上皮区室（不包括 AT1 和 AT2 细胞）的进一步分析确定了预期的纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞、上基底细胞、分裂基底细胞、棒状细胞、SMG 粘液和浆液细胞群以及罕见的氘核细胞、离子细胞和刷状细胞以及神经内分泌细胞。除此之外，我们在浆液细胞、粘液细胞和棒状细胞/杯状细胞之间发现了一个新的群体，其标记基因与人食道中的 SMG 导管细胞重叠，并在气管中优先定位。因此，我们假设这些细胞是human呼吸道的柱状非纤毛导管细胞，以前仅在单细胞水平的小鼠中表征。 ALDH1A3、MIA 和 RARRES1 的 smFISH 染色验证了 SMG 的定位，并将这些细胞与浆液、粘液和其他上皮细胞区分开来。与 SMG 粘液和浆液细胞相比，单细胞和 Visium 数据的 Cell2location 整合还可以区分 SMG 导管细胞的不同位置，为鉴定新的不同细胞类型提供正交证据。此外，Velocyto 分析表明这些细胞位于朝向表面上皮细胞群的轨迹上，支持在气道表面再生中的潜在作用，正如在小鼠中所证明的那样
从 snRNAseq 揭示了一个额外的群体，表现出基底上皮和肌肉标记物，定位在腺体周围，与肌上皮细胞特征一致。 FHOD3、上皮标志物 KRT14 和肌肉标志物 TAGLN 在相同细胞中的共定位证实了 smFISH 的肌上皮细胞特征。 有趣的是，小鼠肌上皮细胞也被证明可以再生表面气道上皮。 这种细胞类型在human中没有得到很好的描述，可能是由于难以将这种细胞类型与气道分离，这与从细胞核数据中exclusive recovery肌上皮细胞一致。 总的来说，研究为新的 SMG 种群提供了human转录组信息，并使用空间转录组学和 smFISH 绘制了 SMG 的成分及其空间位置。
- 注： IgA plasma cells in human airways co-localise with submucosal glands (a) UMAP of single nuclei RNA-seq airway epithelial cells (excluding parenchyma AT1 and AT2 epithelial cells) with dashed line around SMG-Duct and myoepithelial cells and a dot plot for the SMG-Duct marker genes. (b) RNAscope staining of mucous, serous and duct cells with respective marker genes MUC5B, LPO and ALDH1A3/RRARES1 in human bronchus
Proportions and gene signatures of the airway epithelial cells
使用考虑了材料、供体和解离方案的统计模型，我们检查了采样的 5 个不同位置的气道上皮细胞的比例，显著性以局部真征率 (LTR) 给出。 正如预期的那样，棒状细胞在薄壁组织中富集，而 SMG 上皮细胞在气管中富集。 虽然供体和方案对上皮细胞类型比例几乎没有影响，但细胞与细胞核的起始材料强烈影响细胞类型组成。 细胞核中 SMG 上皮细胞捕获增加，而其他上皮细胞类型的捕获通过解离成单个细胞更好地实现
利用我们的多位置数据，我们比较了纤毛细胞的基因表达，纤毛细胞是五个位置中存在的最丰富的细胞类型之一。 我们仅使用 snRNAseq 数据避免了由于位置之间不同的环境 RNA 污染而产生的任何artefacts，其中样本在 10X 测序反应的位置之间汇集。 使用线性混合模型，我们在气管纤毛细胞中检测到 80 个与其他位置（LTSR>0.9）相比差异表达的基因，其中许多基因在鼻咽癌中上调，包括 FBXL7、TSHZ2 和 RAET1E。 我们还检查了 ACE2 表达，一种 SARS-COV-2 进入基因，我们发现该基因在来自气管的纤毛细胞中最高，而在肺远端区域较低，ACE2 的表达可能与之前报道的 AT2 细胞更相关。
Altogether, we describe transcriptomes for two key cell types involved in the SMG structure in the human airways which also functions as an immunological niche which we describe below.
Immune cells in the lung and airways
Myeloid cells show previously undescribed heterogeneity
对于免疫区室，我们确定了所有主要细胞群，包括髓细胞、T&NK、B 谱系、肥大细胞和巨核细胞，对它们进行单独分析以揭示以前未描述的异质性，尤其是在髓细胞中。我们发现了所有主要的骨髓细胞类型（DC、单核细胞和巨噬细胞），包括许多已知和新的subset。先前确定的巨噬细胞subset包括血管内巨噬细胞（表达 LYVE1 和 MAF）、Macro-AW-CX3CR1、Macro-CHIT1（CHIT1 表达在哮喘、COPD 和肺纤维化中起作用）和间质巨噬细胞（宏间质表达趋化因子 CXCL9、10 和 11） . 我们发现了一个表达单核细胞 CD14 和巨噬细胞标志物的新cluster，称为宏中间体。在肺泡巨噬细胞中，出现了另外两个cluster：分裂细胞 (Macro-alv-dividing) 和表达金属硫蛋白的新细胞cluser (Macro-alv- MT) 包括 MT1G、MT1X 和 MT1F。金属硫蛋白具有结合和代谢金属离子、免疫和应激反应的作用，因此该群体可能具有应对空气污染的功能。最终罕见的巨噬细胞新群体表达了包括 CXCL8 在内的趋化因子, CCL4 和 CCL20 并被命名为 Macro-CCL。虽然之前在间质巨噬细胞中发现了 CCL4 的表达，但 CXCL8 的表达nd CCL20 区分了这个新的subset。 CXCL8 表达的失调与多种肺部疾病有关，包括感染、哮喘、IPF 和 COPD，并被确定为银屑病皮肤中单独巨噬细胞群的标志物。
Overall, we have identified multiple known and novel myeloid populations in the healthy human lungs and airways, many of them expressing specific sets of chemokines, orchestrating the complex lung immune homeostasis.
- 注：UMAP plots of myeloid, T/NK and B cell lineage cells, colored by cell type.
Different subsets of T & NK cells in the lung and airways
T 淋巴细胞和自然杀伤 (NK) 细胞包括所有主要细胞类型（CD4、CD8、粘膜相关不变 T (MAIT)、NK、NKT、先天淋巴细胞 (ILC)）及其subset。在 CD4 隔室中，我们区分了初始/中央记忆 (CD4-naive/CM)、效应记忆/效应 (CD4-EM/效应)、调节性 T 细胞 (Treg) 和组织驻留记忆 (CD4-TRM) 细胞。在 CD8 细胞中，我们发现了 gamma-delta T 细胞 (γδT) TRMs (CD8-TRM)，如文献中所知，它在我们的空间数据中很好地定位于气道上皮。此外，我们看到了两个不同的 CD8+ cluster，类似于在表达 CX3CR1 和 GZMB (CD8-EM/EMRA) 以及 CRTAM 和 GZMK (CD8-TRM/EM) 的跨组织分析中在肺中发现的群体。 NK 子集包括具有标记物 ITGAD/CD11d、LAG3、KLRC3/NKG3E、KLRC2/NKG2C (NK-CD11d)、CD16+ (NK-CD16hi) 和 CD56+ NK 细胞（NK-CD56 ）的cluster。 CD11d 阳性的 NK 细胞在小鼠和human感染中都具有激活或病毒反应，并且之前在human血液中也有发现。据我们所知，这是第一次在健康人肺中描述该subset 。
与骨髓细胞cluster相比，T 和 NK 细胞在细胞类型比例上显示出惊人的供体间变异性，这与适应性免疫区室中较高的个体间变异性一致。 来源、材料和协议的位置解释了任何细胞类型比例几乎没有变化，包括 B 细胞
我们还获得了 TCR VDJ 测序数据，证实了 MAIT 细胞类型注释（优先使用 TRAJ33 和 TRAV1-2），并且与记忆和effector subsets，幼稚和 Treg 群体的克隆扩增较低。 最后，我们表明，正如预期的那样，个体之间没有克隆共享，但在一个供体的肺的多个位置发现了扩增的克隆。
Co-localisation of IgA plasma cells with the SMG
B 细胞包括初始 B 细胞和记忆 B 细胞，以及被进一步注释为免疫球蛋白 (Ig) IgG 或 IgA 分泌浆细胞和浆母细胞的浆细胞，并且这种注释得到了 VDJ-seq 数据通过 Scirpy BCR 同种型分析的支持。 IgA 对粘膜免疫很重要，是气道样本中最常见的同种型，而在实质中仅位居第三。 有趣的是，我们观察到，在来自鼻腔和支气管刷样本的单细胞数据中，与健康对照相比，COVID-19 患者中 IgA 浆细胞相对于 IgG 的比例有所增加。 IgA 与 IgG 浆细胞的区别标志物包括 CCR10 和 B 细胞成熟抗原 BCMA (TNFRSF17)，它们分别对浆细胞定位和存活很重要
使用 Visium ST，我们在气管和支气管切片的气道 SMG 中观察到 IgA B 浆细胞的定位，而不是 B 或 IgG 浆细胞。 所有 Visium 切片的解剖区域注释证实了 IgA 浆细胞与导管、浆液和粘液 SMG 细胞的共定位，而 IgG 映射到免疫浸润。 IgA 浆细胞与 SMG 的映射在human蛋白质图谱中得到证实，该图谱显示支气管和鼻咽的 SMG 区域中存在大量浆细胞 (MZB1+)，以及 1970 年代的一项研究显示 IgA 血浆的定位 人气道中的细胞 SMG
使用多重 IHC，我们以单细胞分辨率显示 SMG 中 IgA2 浆细胞的特定存在，而 IgG 阳性细胞仅存在于 SMG 外的气道中，与 Visium ST 一致。 我们还在 SMG 中检测到 IgD+ 幼稚 B 细胞和 CD3+CD4+ T 辅助细胞，表明 IgA 浆细胞得到了一组细胞类型的支持，这些细胞类型可以协调 B 细胞成熟，将 IgA 直接分泌到气道粘液中。 我们假设这些不同的细胞类型共同构成了一个免疫生态位，我们称之为腺相关淋巴生态位 (GALN)。 了解 SMG 的免疫机制有助于了解疾病，因为 SMG 中浆细胞数量增加已在吸烟者、COPD 和川崎病中显示
- 注：(d) Number of B lineage cells with different Ig isotypes in airway (trachea & bronchi) from the analysis of VDJ amplified libraries. (e) Percentages of different isotypes of B and plasma cells from the nasal and tracheal brushes of COVID-19+ and healthy control patients. Patients with over 20 B and plasma cells were considered. (f) Visium ST results show IgA plasma cells specific localisation in the glands. H&E on bronchi with manually annotated gland regions shown in blue, Cell2location density scores for IgA-plasma cells, and normalised average cell abundance (dot size and color) for SMG cell types and B lineage cell types across the manually annotated regions in the Visium data. (g) Multiplex IHC staining of human trachea for the SMG structure (Hoechst for nuclei, EpCAM for epithelium, Phalloidin for actin, CD31 for vessels), B lineage markers (IgD, IgA2, IgG) and CD4 T-cells (CD45, CD3, CD4). Arrows point to CD45+CD3+CD4+ cells. Scale bar 100 µm.
Cell-cell interactions and the SMG immune cell niche
为了了解 SMG 中 B 细胞、IgA 浆细胞和 T 细胞的共定位，我们探索了支持 SMG 作为潜在免疫生态位的分子机制。 我们报告说 pIgR 的表达促进了聚合 Ig 跨表面上皮的转胞吞作用，在所有 SMG 上皮细胞中都很高，粘膜上皮趋化因子 (MEC)/CCL28 也是如此，已知它通过 CCR10 在其他粘膜部位招募 IgA 浆细胞。 使用细胞间相互作用分析工具 CellChat 分析来自气道的细胞，我们发现，除了 SMG 细胞和 B 浆细胞（结合 IgA、IgG 和浆母细胞）之间的 CCL28-CCR10 轴外，预测 SMG-Duct 细胞与 CCR6 通过 CCL20 在记忆和初始 B 细胞和 CD4 T 细胞（组合 CD4 subset，不包括 Treg）上进行。
Cellchat 还预测了 SMG 上皮细胞（特别是 SMG-Duct 细胞）和 CD4-T 细胞表达的 HLA 基因之间的相互作用。 SMG-Duct 细胞中 HLA-DRA 和 HLA-DRB1 的表达与纤毛细胞相当，并且正如预期的那样，低于 B 记忆和幼稚细胞。有趣的是，我们观察到 IHC 在腺体中强烈表达 HLA-DR 蛋白，但在表面上皮细胞中没有观察到，表明转录物和蛋白质水平之间存在差异。我们还在 SMG 上皮细胞中发现了 CD40 的表达，CD40 是 APC-T 细胞相互作用的关键共刺激分子。这两种因子的表达表明 SMG-Duct 细胞可以将抗原呈递给 CD4 T 细胞。先前已在气道和鼻上皮细胞中观察到 HLA-DR 和 CD40 的表达，从而促进体外 T 细胞增殖。有趣的是，在唾液腺导管而非其他细胞中观察到 CD40 表达，并且在干燥综合征（一种全身性自身免疫性外分泌病）中表达上调
为了进一步支持免疫生态位，增殖诱导配体 (APRIL) 是 B 细胞存活、分化和类别转换的重要因素，由 SMG-Duct 细胞表达，并在较小程度上由 SMG-浆液细胞表达。根据受体 TACI 和 BCMA 的差异表达，预测了 SMG 上皮细胞与 B 记忆和 B 浆细胞之间通过这些配体的细胞间通讯。在结肠中，可以在肠上皮细胞上诱导 APRIL 表达并导致局部组织环境中的 IgA2 类转换重组 (CSR)。我们还发现一部分 B 记忆细胞表达激活诱导的胞苷脱氨酶 (AIDCA)，表明 SMG 通过 TACI-APRIL 信号传导局部 CSR 的可能性。 SMG-Duct 和在较小程度上 SMG-Serous 细胞表达 IL-6，预测其与 B 血浆上的 IL-6R/IL-6ST 和 CD4-T 细胞subset（CD4-naive/CM）相互作用T细胞。 IL-6 与 APRIL 结合使用，可诱导和支持长寿命浆细胞，并且是 IgA 定向浆细胞中 IgA 分泌的有效诱导剂。此外，IL-6 已被证明是 CD4 T 细胞记忆形成和克服 Treg 介导的抑制的必需因素。唾液腺上皮细胞已显示以 IL-6 依赖性方式诱导 CD4 T 细胞分化为 Tfh 细胞，从而诱导 B 细胞增殖。在这项研究中，仅在与唾液腺上皮细胞共培养时也诱导了 B 细胞的增殖，这表明存在额外的 T 非依赖性机制。 IL-6 在哮喘和 COPD 患者的血清和支气管肺泡灌洗液中上调，表明 SMG 中 IL-6 信号的平衡对疾病很重要
In conclusion, we have identified the localisation of IgA plasma cells, naive/memory B cells and T cells at the SMG along with a large number of molecular signalling pathways involved in B lymphocyte recruitment, antigen presentation and both T cell-dependent and -independent maturation and survival. These pathways are known to be functional in other secondary lymphoid organs, including within MALT, and we now show their possible involvement in establishing and maintaining the GALN of the lung.
Summary and Conclusions
我们已经对人肺中细胞类型的转录组进行了详细注释； 评估它们沿气管支气管树和薄壁组织的不同位置。 在提供的 193,000 多个高质量转录组中，我们确定了 77 种细胞类型或状态，其中首次包括软骨细胞、外周神经细胞和 SMG 导管细胞的转录组，以及Schwann细胞、肌肉和巨噬细胞的subset。 在新发现的细胞类型中，我们发现了在成纤维细胞、平滑肌和巨噬细胞区室中表达特定趋化因子组的特化细胞类型。 我们还在气道黏膜下腺内发现了一个新的 IgA 免疫细胞生态位，我们将其称为腺体相关淋巴生态位 (GALN)，具有潜在的疾病相关性。
这项研究的优势在于结合了多种互补技术：scRNAseq、scRNAseq、VDJ 分析和空间转录组学。 尽管 snRNAseq 在检测到的基因数量上比 scRNAseq 更有限，但不会受到酶处理和解离假象的影响。 这使我们能够定义软骨细胞和软骨膜成纤维细胞 (PC-Fibro) 的转录组，并分离稀有细胞类型，如Schwann细胞subset和神经相关成纤维细胞 (NAF)。 Visium ST 使我们能够展示组织内细胞类型的定位； 确认那些已知的（如纤毛上皮细胞），那些以前在转录上未定义的如软骨细胞，以及人肺中完全未描述的细胞类型。
我们表征了可能合作在 SMG 产生免疫生态位的细胞类型，发现在淋巴结、MALT 和免疫活性组织（如肠道）中也观察到的信号通路，导致 T 细胞依赖性和独立 B 细胞反应。我们提出了 SMG 上皮细胞之间的细胞 - 细胞相互作用，包括 SMG-Duct 细胞、CD4-T 细胞和 B-naive、-memory 和 IgA 分泌浆细胞，我们映射到 SMG。 B 谱系细胞的存活、成熟和潜在的类别转换得到 APRIL 和 IL-6 的支持，由 SMG-Duct 细胞表达，提供 T 细胞独立因子。此外，SMG 上皮细胞具有通过表达 MHC-II 和 CD40 诱导 T 细胞依赖性免疫和 B 细胞反应的潜在能力。进一步的功能分析将不得不调查我们的发现，检查我们检测到的 T 细胞的作用，并测试 SMG-Duct 细胞作为专业 APC 的功能以及在这些位点促进类别转换重组和somatic hypermutation的功能。
我们描述的许多信号通路已经在其他组织中观察到，并且特别详细地描述了将 IgA 浆细胞募集到乳腺和肠道的Peyer’s patches。 在气道中没有观察到健康肺组织内的此类次级淋巴结构或通路，但我们假设 SMG 微环境可能具有类似的功能。
总体而言，本文提供的多组学数据提供了人肺内细胞类型和状态的全面视图，包括宏观和微观解剖细胞定位信息。 我们展示了对肺内外的许多疾病状况具有潜在影响的新细胞类型，并通过计算分析了细胞相互作用，促进了我们对肺组成和免疫的理解。 这种综合分析使我们能够采用一种系统方法，该方法开始将器官功能定义为来自不同区室的细胞之间相互作用的结果。 在新定义的 GALN 上观察到的相互作用可能与其他 IgA 分泌位点有关，例如乳腺、唾液腺和泪腺。
我们的发现可能与传染病生物学高度相关，因为 IgA 分泌对于对抗传染性病原体（如 SARS-CoV-2）至关重要。我们报告了 COVID-19 患者气道中更高比例的 IgA 浆细胞，支持 IgA 免疫生态位的重要性。鼻用疫苗可能会引起强烈的局部 sIgA 反应，但目前所有获得许可的 COVID-19 疫苗都是肌肉注射的。这些疫苗在预防严重疾病方面非常有效，但临床前研究表明，它们对防止病毒复制和上呼吸道脱落的保护作用很小。由于诱导上呼吸道和下呼吸道的粘膜 IgA 反应，正在开发的新型鼻疫苗在非human灵长类动物中显示出有希望预防病毒的复制和脱落。在human中是否也是如此仍有待确定，但在 COVID-19 患者中，与 IgM 或 IgG 相比，SARS-CoV-2 中和与 IgA 的相关性更密切，并且在眼泪、鼻液和唾液中观察到 IgA 滴度增加进一步强调了 IgA 免疫生态位在 COVID-19 免疫中的重要性。更好地了解粘膜 IgA 免疫生态位和建立该生态位的途径（我们在此描述）可能会提供增强这种免疫反应的选择。
- 注：Cell-cell signaling at submucosal gland for B cell recruitment and survival niche. (a) Expression of PIGR and CCL28 in epithelial cells. (b) CellChat cell-cell interaction analysis pathways for CCL chemokines present from SMG epithelial cells to B cells (memory, naive and IgA/IgG/plasmablast combined) or CD4-T cells (CD4-naive/CM, CD4-EM/Effector and CD4-TRM combined) within airway tissue (trachea and bronchi). Arrow direction denotes chemokine-receptor pairs on specific cell types, arrowhead thickness reflects the relative expression of chemokine signal from each cell type. (c-d) Expression dot plot of relevant chemokines and corresponding receptors as shown in (b). (e) CellChat analysis as in (b) showing signalling from HLA genes expressed by SMG epithelial cells, signaling to CD4 on CD4-T cells. Arrow direction denotes ligand-receptor pairs on specific cell types, arrowhead thickness and proportion of the circle by each HLA gene/SMG epithelial cell type reflects the relative expression. (f) RNA expression of HLA-DRA, HLA-DRB1 and CD40 in B cells (as professional antigen presenting cell controls), ciliated and SMG epithelial cells from sc/snRNAseq. (g) Protein staining of HLA-DR and EpCAM in human trachea showing strong expression of HLA-DR in the SMG. (h-i) CellChat analysis as in (b) and (e) showing signalling of APRIL and IL-6 from SMG epithelial cells to relevant B cell subsets and CD4-naive/CM. Arrow direction denotes ligand-receptor pairs on specific cell types, arrowhead thickness and proportion of the circle for each gene/cell type reflects the relative expression. (i) Expression dot plot of relevant ligands and corresponding receptors as shown in (h). (j) Schematic of SMG immune niche showing immune cell recruitment and extravasation facilitated by venous endothelial cells and IR-Ven-Peri and signaling patterns between SMG gland epithelial cells, CD4-T cells, B-naive/memory cells and B-plasma cells to attract immune cells and promote antigen-specific T cell dependent and T cell independent pathways leading to IgA secretion at the SMG.
Method
Spatial mapping of cell types using Visium Spatial Transcriptomics and cell2location（单细胞空间联合）
Single cell and nuclei RNA-seq analysis
BCR and TCR analysis from VDJ-data
VDJ analysis was done with Scirpy 0.6.0 (https://www.jianshu.com/p/7ade4e36701d). For TCR data, clonotypes were defined based on CDR3 nucleotide sequence identity. For BCR data, clonotypes were defined based on the Hamming distance between CDR3 amino acid sequences with a cutoff of 2 and orphan VJ chains removed. In both cases, V gene identity was required and the CDR3 sequence similarity was evaluated across all of a cell pair’s V(D)J chains.
Poisson linear mixed model for cell type composition analysis
Poisson regression with various metadata as covariates was applied to adjust confounding effects on the cell type count data as previously describe. We used Location as biological factor and Protocol, Material
(scRNAseq vs snRNAseq) and Donor as technical factors in the model as random effects to overcome the collinearity.
Cell-cell interaction analysis
Cell-cell interaction from scRNAseq data was predicted using CellChat (Jin et al. 2021). B plasma subsets were combined (B-plasma) and cell types of interest (B-naive, B-memory, SMG-Duct, SMG-Mucous, SMG-Serous, CD4-naive/CM, CD4-EM/Effector and CD4-TRM) were downsampled to 200 cells per cell type per donor. Analyses were performed both with individual CD4-T cell subsets and all CD4 subsets combined. Normalised count matrix along with cell annotation metadata was processed through the standard CellChat pipeline, except that the communication probability was calculated with a truncated mean of 10%.
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