今天给大家分享的是2021年4月份发表在Nature reviews Clinical Oncology（IF= 53.276）上的综述Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy。本文阐述了使用以scRNA-seq为主的单细胞分析技术取得的进展，特别是在肿瘤临床治疗、免疫疗法方面，讨论了单细胞方法在回答重要研究问题方面日益增长的效用。本文篇幅较长，在尊重原文框架的基础上结合小编的理解帮大家梳理了一下核心论点和经典案例，方便大家快速了解单细胞测序以及肿瘤免疫的最新进展，现将大纲列出。
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0 背景
0.1 单细胞测序相比于传统bulk测序的技术优势。肿瘤是一个复杂的恶性肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞的混合体，具有瘤内异质性和瘤间异质性（Figure1）。整个肿瘤微环境当中包括了促进肿瘤和抑制肿瘤的各种信号来调控肿瘤生长和肿瘤进化。传统意义上的bulk基因组和转录组分析已经提供了大量的关于肿瘤生长、进化的视角，但是一些特异的细胞群体或细胞状态所展示的信号会在bulk测序时被掩盖，而这种特异的细胞群体或状态有时也是非常关键的，比如肿瘤干细胞和对于肿瘤治疗应答相关的免疫细胞。因此，在基因组、转录组、表观组和蛋白质组层面对细胞个体进行检查能够克服传统bulk层面的限制，进行更加精细的细胞、分子水平的剖析。
Figure1 肿瘤微环境的组成
Therapeutic Targeting of the Tumor Microenvironment, Bejarano, 2021, Cancer Discovery
0.2 单细胞测序技术及分析方法的快速发展。由于测序技术和细胞分离技术的快速发展，测序细胞数量由最初的几百个细胞发展到成千上万个细胞，并且测序性价比越来越划算。分析方法也在持续改进，包括细胞类型的确定、高维数据的降维、无监督聚类、系统发生建模、轨迹推断、RNA速率、多数据集的协同分析等。
0.3 肿瘤免疫学中悬而未决的科学问题。肿瘤和免疫细胞异质性，特别是抗原呈递分子表达的异质性、T细胞克隆型与表型的关系、TME中免疫检查点相互作用的网络、肿瘤细胞与免疫细胞之间以及不同免疫细胞类型之间的空间功能关系等。在此，我们关注高维单细胞分析是如何被用来研究肿瘤细胞和其微环境之间的相互作用，特别是如何与抗肿瘤免疫治疗应答相关的。
0.4 如何在肿瘤免疫学中结合单细胞测序方法呢？（Figure2）首先，对肿瘤组织进行组学层面的单细胞测序，依据研究目的选择合适的组学测序手段，如果有对应患者的外周血样本用来监测免疫指标那就更好了。其次，依据组学测序数据对肿瘤微环境的成分进行分析，肿瘤细胞关注异质性，免疫细胞关注细胞亚型及状态，建立肿瘤免疫相关的指标或signature。最终，选择合适的具有免疫治疗策略的数据集进行进一步临床上治疗方式选择、治疗监测及应答情况、生存预后等方面验证。
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Figure2 免疫肿瘤学中单细胞分析的工作流程
1 单细胞组学
1.1 转录组
单细胞RNA测序(scRNA-seq)是指一种能够对单个细胞中转录本进行非靶向定量的技术，常用于识别新的细胞类型、确认罕见的细胞群、构建细胞状态和系统发育的图谱（Figure3）。
Figure3 基于scRNA-seq研究肿瘤免疫学的杰出工作
1.1.1 肿瘤细胞和免疫治疗应答
单细胞RNA测序在肿瘤研究中揭示的最主要特征就是瘤内、瘤间的异质性。在胶质瘤、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌和卵巢癌等多种肿瘤类型中，当应用scRNA-seq技术对肿瘤细胞进行聚类时，发现肿瘤细胞主要是依据细胞的患者来源进行分组的，每个肿瘤患者都拥有个体独特的进化轨迹。与此同时，在患者之间识别普遍存在的具有特异转录组状态的肿瘤细胞也是可行的，有助于重新理解肿瘤类型和细胞层次结构，同时也可以识别与治疗应答、治疗抵抗相关的转录组signature。例如，在31位接受过免疫检查点抑制剂（ICIs，immune-checkpoint inhibitors）治疗的黑色素瘤患者中，基于scRNA-seq数据的分析揭示肿瘤细胞具有一个与T细胞排斥和内源性抵抗机制相关的转录组signature，导致CDK4的表达增加，伴随着抗原处理和呈递过程（B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-E）、干扰素信号和补体系统的相关基因表达下降[Jerby-Arnon, L. et al. A cancer cell program promotes T cell exclusion and resistance to checkpoint blockade. Cell 175, 984–997.e24 (2018).]。
1.1.2 免疫、基质细胞和免疫治疗应答
从整体上来了解免疫细胞组成和状态对于现在的免疫治疗应答、抵抗的了解是十分必要的，最初科学家们聚焦在建立详细的免疫细胞图谱，这既包括非肿瘤的组织和肿瘤的环境。例如Szabo等[Szabo, P. A. et al. Single-cell transcriptomics of human T cells reveals tissue and activation signatures in health and disease. Nat. Commun. 10, 4706 (2019)]通过分析来自肺部、淋巴结、骨髓和血液的50,000个静止和激活的T细胞，生成了一个细胞图谱。然后，作者将已发表的非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌或黑色素瘤患者的肿瘤相关T细胞的scRNA-seq谱投影到他们的非恶性T细胞激活状态图上，发现肿瘤组织这种包含状态激活的CD8+ T细胞，但没有功能激活的CD4+ T cells（CD8+T细胞通过配体-受体途径发挥细胞免疫功能，CD4+T细胞分泌特异性抗体发挥体液免疫功能，肿瘤免疫主要由CD8+T细胞介导）。此外,瘤内表达衰竭标记物的CD8+ T细胞也表达了与常规CD8+ T细胞效应功能和持续增殖相关的基因。
将这种单细胞转录图谱扩展到一系列肿瘤类型的TME，揭示了癌症免疫反应的异质性和多样性。一项重要的发现是，基于细胞状态的细胞聚类群体往往不能清晰地分离成基于细胞表面蛋白表达的传统免疫细胞亚群，这种差异驱动着科学家们对TME中免疫细胞角色，特别是T细胞状态，进行更加深入地探讨。Sade-Feldman等[Sade-Feldman, M. et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell 175, 998–1013.e20 (2018)]分析了来自经免疫检查点抑制剂治疗的32例转移性黑色素瘤患者的肿瘤活检样本，确定了11个免疫细胞亚群，聚焦于CD8+ T细胞发现了与免疫治疗应答、抵抗相关的两种细胞状态。分析应答患者样本的细胞状态发现，与记忆细胞、激活状态和细胞存活相关的基因表达增加，与共抑制效应相关的基因表达减少。相比之下，无应答者的细胞状态则更为丰富，包括与T细胞衰竭相关的基因表达增加(例如ENTPD1, BATF, HAVCR2, PDCD1, LAG3和CTLA4)。值得注意的是，有应答者和无应答者的这种区别在治疗前和治疗后的肿瘤浸润淋巴细胞中都可以观察到，因此，使用这些signature就可以在免疫治疗前，预测患者是否会对即将接受的免疫治疗产生应答。
1.1.3 细胞互作分析
肿瘤细胞或免疫细胞和/或基质细胞之间具有十分复杂的相互作用，这些相互作用在癌症生物学中起着至关重要的作用。这种细胞-细胞之间的互作关系可以从scRNA-seq数据中计算受体-配体的表达值相关性进行研究。同时，为了更好地理解肿瘤细胞和TME之间复杂的交互作用，包括单细胞空间转录组方法等新的技术也正在快速发展，使探索细胞-细胞物理相互作用成为可能。目前，已经开发的广泛应用的细胞互作分析算法包括CellPhoneDB、CellChat、iTALK、NicheNet等，本处不再赘述。
1.1.4 scRNA-seq的缺陷
第一，scRNA-seq数据是嘈杂的转录组信号。真核细胞转录并不以稳定的基础速率进行，而是以脉冲形式出现。因此，在一个特定的时间点检测到细胞中特定基因的转录本是一个不明确的结果，对结果的解释应侧重于通路分析和基因集合富集分析，而不是单个基因的表达或功能作用。
第二，仅利用转录组数据来建立基因型和表型之间的相关性仍然具有挑战性。例如，scRNA-seq数据已被用于推断体细胞拷贝数变异CNV，但这仅适用于基因组上相对较大区域的拷贝数缺失或扩增，检测点突变的能力仍然十分有限。因此，在评估个体肿瘤细胞体细胞突变对治疗反应或耐药性的影响时，scRNA-seq方法是一种次优的方法。
第三，除了scRNA-seq的这些固有局限性之外，与样本采购和处理相关的具体细节也会混淆结果，这对这些技术的临床适用性具有重要意义。事实上，scRNA-seq依赖于存活的单细胞悬液，这种悬液很容易从外周血或淋巴结中获得，但通常很难从实体肿瘤组织中获得。解离方法和超低温保存条件的差异也可以引起转录组范围内的大量变化。研究组织发育的研究人员发现，单核RNA测序(snRNA-seq)的工作流程更加精简，可适用于许多不同的组织类型，与冷冻样本兼容，该方法已开始应用于肿瘤样本，并将大大提高单细胞方法的临床应用。
第四，在不同的时间处理样品，即使有轻微的技术变化，也会产生严重的批处理效应。在处理批次效应时，需要把控好真正的生物学变异的同时去除技术变异，目前已有多种校正批次效应的方法，用于普通的RNAseq数据整合时的批次矫正分析，如ComBat 和limma，其也可以用于单细胞批次矫正处理。然而，由于单细胞数据的drop out以及RNA 扩增和捕获过程中的失败，需要新的批次处理的技术，例如Seurat、Harmony、LIGER、fastMNN，本文不再赘述。
1.2 蛋白质组
1.2.1 质谱流式细胞技术
尽管同时检测的表位数量受到荧光团之间光谱重叠的限制，流式细胞术长期以来一直是研究人员在单细胞水平上评估蛋白质表达的主要工具。质谱流式细胞技术的出现，包括使用同位素标记抗体，大大增加了可同时分析的标记物的数量，从而使同时检测单个细胞上的多种蛋白质成为可能。总的来说，单细胞蛋白质组学方法的分析精度高于现有的scRNA-seq方法。此外，与RNA相比，蛋白质的半衰期更长，这意味着蛋白质测量不太容易受到scRNA-seq数据中经常观察到的波动的影响。基于抗体靶向的方法还提供了额外的检测能力，如可以检测翻译后修饰或通过细胞形态测定法评估形态特征。然而，与流式细胞术类似，质谱流式细胞技术的靶向性要求对分析物进行前瞻性选择，与使用scRNA-seq同时检测数百至数千个RNA转录本的非靶向性相比，这可能会使细胞分组的识别产生偏差。
Mass cytometry是一种特别有用的方法，可以在单细胞水平刻画参与免疫治疗应答的细胞的特异性表型特征，正如两项在黑色素瘤患者中对免疫检查点抑制剂治疗应答的调查结果所示。在第一项研究中[Krieg, C. et al. High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy. Nat. Med. 24, 144–153 (2018).]，研究人员使用流式细胞术证明，治疗前外周血中高比例的经典单核细胞是对抗PD1抗体反应的一个强有力的预测因子，并且在31个患者的独立验证集中证明了这一现象。在第二项研究中[Gide, T. N. et al. Distinct immune cell populations define response to anti-PD-1 monotherapy and antiPD-1/anti-CTLA-4 combined therapy. Cancer Cell 35, 238–255.e6 (2019).]，作者分析了一组黑色素瘤患者的活检样本，这些患者要么接受抗PD1抗体作为单一治疗，要么与抗CTLA4抗体联合治疗。对一个包含43个marker的panel数据进行降维分析，确定了14个免疫细胞群，包括3个不同的T细胞群：激活、分化和耗竭状态，并且进一步通过联合RNA-seq分析揭示了marker基因表达与治疗方案的应答性的相关性。这些观察结果强调了在单细胞水平评估免疫细胞表型的重要性。
1.2.2 新兴的单细胞蛋白质组分析技术
新一代光谱分析仪有望将基于荧光的流式细胞术的能力扩展到与质谱流式细胞术相媲美的水平。这些系统相的一个优势是能够利用大量已经可用的荧光标记抗体，因为它们不像质谱流式细胞术那样破坏细胞，使细胞的分类和分离为后续的实验提供了可能。作为另一种新兴技术，用寡核苷酸barcode标记抗体，而不是荧光团或重金属离子，消除了同时可分辨靶标数量的限制。这些光谱分析仪和微流体系统的新平台仍处于开发的早期阶段，需要在其他临床环境中进行验证。尽管如此，迄今为止的早期研究表明，它们将在免疫肿瘤学中发挥越来越重要的作用。
1.3 基因组
单细胞的全基因组和全外显子组测序方法已经开发出来，这些方法还没有过渡到高通量的高维分析的阶段，很大程度上是因为这种测序的高成本妨碍了对每个病人进行大规模的细胞测序。一种更有效的方法是首先对肿瘤DNA样本进行深度测序以识别体细胞突变，然后对单细胞DNA进行定向测序以精准检测假定的驱动突变或克隆结构中的突变。虽然尚未应用于免疫治疗，但该系统已用于分析成千上万的单细胞，通过诊断、缓解和复发来追踪急性髓系白血病患者的特定突变，从而证明了这项技术的前景。
1.4 表观组
表观基因组分析方法，如利用ATAC-seq、基于亚硫酸氢盐的DNA甲基化测序、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和染色体构象捕获技术(3C和Hi-C)，都已被用于单细胞分析。在这些方法中，单细胞ATAC-seq是目前唯一具有足够高通量的方法，因此被广泛应用。单细胞表观基因组学是一个快速发展的领域，特别是当与单细胞转录组结合时，很可能成为肿瘤学中单细胞分析的下一个主要进展。
1.5Multimodal analysis
将不同的单细胞分析方法结合起来进行研究的苗头正在逐渐浮现，到目前为止，这种Multimodal方法在研究免疫治疗应答方面的应用还很有限，这里简要回顾了几种具有广泛适用性的比较有前景的方法。
1.5.1 RNA or DNA + 蛋白质
将单细胞蛋白质检测纳入scRNA-seq协议的技术，如CITE-seq和REAP-seq，使用抗体与寡核苷酸barcode结合，通过scRNA-seq的cDNA测序步骤，从而使蛋白质检测能够进行而不受光谱重叠或可分辨金属离子数量的限制。在非靶向转录组分析中加入以抗体为基础的检测数十至数百种蛋白质的能力，通过在传统免疫学框架内定义转录cluster，结合蛋白质信息可减弱转录组dropou，这将大大提高评估TME的能力。在单细胞DNA测序方面，使用寡核苷酸标记抗体也已纳入Tapestri工作流程，这提供了一个直接连接基因型和表型的方法。
1.5.2 谱系追踪
scATAC-seq数据包含来自线粒体基因组的测序reads，虽然这些信号最初被认为是实验上的麻烦，但随着人们认识的不断加深，这一特性使线粒体突变的检测得以实现，并且可用于克隆追踪。因此，scATAC-seq能够同时检测细胞谱系（通过线粒体基因组）和细胞命运（通过核表观基因组）。虽然线粒体突变也可以在scRNA-seq数据中检测到，但因为线粒体基因组的覆盖率较低且不稳定，所以scRNA-seq检测的线粒体突变不像scATAC-seq数据那样稳定。这种谱系追踪分析可以在未来应用于肿瘤免疫领域，更好地了解哪些肿瘤细胞克隆对特定治疗反应会expansion或extinction，从而筛选哪些克隆可能与治疗耐药性有关。
2 单细胞TCR分析
T细胞是集体免疫系统中抗肿瘤免疫的主要组成部分，大多数FDA批准的癌症免疫治疗都是聚焦与T细胞。TCR（TCR, T Cell Receptor）就像是T细胞的“眼睛”和“耳朵”，T细胞受体一般由alpha链和beta链组成，T细胞识别MHC抗原肽就是通过TCR来实现的，与抗原呈递细胞形成TCR-抗原肽-MHC的结构。由于人体内非己物质的种类可能是各种细菌、病毒以及各种衰老和癌变的自身细胞，TCR也需要多种类型来识别抗原，基因组重排导致了TCR的多样性。在肿瘤组织中，肿瘤抗原最终作为抗原-MHC复合物呈现，并被肿瘤浸润T细胞上的TCR识别，才会使免疫疗法产生有效的抗原特异性抗肿瘤免疫反应。越来越多的证据表明，许多肿瘤浸润性T细胞只是“旁观者”，无法识别和攻击肿瘤细胞。因此，有些肿瘤可能看起来被免疫细胞高度浸润，但由于缺乏具有抗肿瘤活性的肿瘤特异性T细胞，肿瘤仍然处于免疫“cold”状态。Bulk TCR测序不能将配对的两个TCR亚基准确分配给单个T细胞，在随后的几年里，许多基于PCR的技术被开发出来，可以测定T细胞TCR互补决定区序列，以便明确地识别肿瘤中单个T细胞的TCR alpha和beta亚基，使个体测序成为可能。结合scRNA-seq和单细胞TCR测序（scTCR-seq）将T细胞表型（如激活、记忆和耗竭）与个体的特异性和TCR克隆型联系起来。综上所述，scTCR-seq、抗原特异性测定和单细胞分析方法的整合使得对免疫肿瘤学进行更详细的研究成为可能。
集成scRNA-seq和scTCR-seq的方法为免疫治疗过程中分析免疫细胞的表型和功能特征提供了一种特别有效的方法。例如，对接受抗PD1抗体治疗的晚期基底细胞癌（n=11）或鳞状细胞癌（n=4）患者的治疗前和治疗后活检样本进行分析，发现治疗后活化和耗竭的CD8+T细胞数量均有所增加。值得注意的是，最大程度的TCR克隆性（意味着最低水平的多样性）是在治疗后耗竭状态的CD8+ TILs中观察到的，而这些克隆型的绝大多数是在抗PD1治疗前未检测到的扩展的新克隆。在治疗前存在的耗竭TIL克隆在治疗后没有扩展，也没有过渡到未耗竭的表型[Yost, K. E. et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat. Med. 25, 1251–1259 (2019).]。
3 高维空间分析
肿瘤免疫微环境的空间变异性越来越被认为是导致大多数癌症类型的异质性和治疗应答的可变性的原因，免疫组化和原位荧光杂交技术都需要先验知识才可以实施。目前，这些传统的方法已经快速发展，同时可视化多种蛋白质、DNA或RNA分子已经不再遥远，一些同时结合空间信息和新一代测序信息的技术已经被提出来，但是仍然处于技术“幼年”阶段。这种高纬度空间分析方法在不远的将来会彻底改变细胞间相互作用、肿瘤细胞和TME之间的关系、TME控制肿瘤免疫学和患者对免疫治疗的反应性等研究方向的方法论，
4 小结
单细胞技术已经席卷整个生物医药领域，并且在特定技术上未来仍然具有巨大的改良空间，单纯挖掘ENA、SRA等公共数据库的单细胞测序数据就足以进行一些科学研究。从相对较少的患者（n=5-50）的深入调查中收集到的见解虽然具有挑战性，但是可以像预实验一样，为使用更经济、有效、直接的方法分析更大的样本集提供非常有价值的信息（Figure4）。本文是肿瘤免疫学领域内里程碑式的综述文章，无论是对于入门级的新手还是即将撰写文章的技术骨干都有一定帮助，感谢您读到这里，希望大家点赞支持一下。
Figure4 在涉及免疫疗法的临床试验中合并单细胞分析的一般框架
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