引物设计

以ZFAND4为例：
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/里选择Gene，搜索ZFAND4：

ZFAND4

选择跟人相关的（第一个，Homo sapiens）。
向下拉，看到有四个不同的isoform：

isoform

点击其中一个isoform，复制全部序列到snapgene，命名为（Homo sapiens zinc finger AN1-type containing 4 (ZFAND4), transcript variant 2, mRNA）：

全部序列

snapgene

把四个isoform全部保存：

四个isoform

点击第一个进去，进行编辑：
首先在NCBI GENE里找到CDS（编码区），复制，ctrl+F到snapgene里，Features-add feature，命名为CDS：

CDS

点击左下角的show aligements，把其他三个isoform复制进来：

SE

这里的红色就代表外显子跳跃事件，我们将外显子跳跃事件的碱基复制，add feature为exon skipping，发现这个外显子跳跃在CDS之外，说明这个SE事件不会影响编码蛋白的改变。

再做STAG2的，前边步骤都相同，ZFAND4的SE事件在CDS内，将SE事件标注为绿色：

SE

将exon的序列，exon前边100-200bp的序列以及exon后边100-200bp的序列copy到primer3网站上，格式为:exon前边100-200bp的序列[exon]exon后边100-200bp的序列:

primer3

点击pick primers，可以得到前边和后边的两个引物ccaaaagattacggcctgag和ccacaattggctcttcatca：

two primers

将他们copy到snapgene，点击Primers-add primer，命名为HSA STAG2 ISO-F：

HSA STAG2 ISO-F

同时后面的引物命名为HSA STAG2 ISO-R。
将引物名称和序列保存到表格：

引物

上述是涉及可变剪接的引物设计，如果是某个分子的引物设计：
选择isoform1（主要的isoform），将分子的CDS区copy到primer3，把下图product size ranges里的150-250和100-300去掉。

primer3