文献阅读-拟南芥防止多精受精的新机制

本次阅读的文章是今天发表在《Nature》上的《Fertilized egg cells secrete endopeptidases to avoid polytubey》一文，通讯作者是武汉大学的孙蒙详老师。

在动物受精之后，为了防止多精受精，其中一种方式即通过释放卵细胞特异表达的金属蛋白ovastacin通过剪切透明带的糖蛋白ZP2以阻止其他的精细胞穿过透明带。植物中通常也不会出现多根花粉管进入胚珠的现象，那么植物中这种polytubey的阻止是如何实现的呢？在先前的研究中，受精前NO对于花粉管吸引物质的Atlure1的修饰可以阻止在珠孔处多花粉管进入，而受精后中央细胞与宿存助细胞的融合亦有助防止多花粉管进入，但是是否在受精后，植物是否可以像动物一样释放一类蛋白酶实现对底物的切割来快速达到防止多精受精仍不清楚。

为了理清这一问题，孙老师组从拟南芥中挑选了两个特异在卵细胞表达的且具备分泌活性的基因，命名为EGG CELL-SPECIFIC1 (ECS1) 和 ECS2。ECS1 和 ECS2属于A1类天冬氨酸肽链内切蛋白酶：含有一个信号肽以及两个酶活位点DTGS 和 DSGT，通过构建两个基因的表达模式可以发现，这两个蛋白特异表达在成熟的卵细胞中，在受精后表达迅速消失，原位杂交的数据更是证明了这一点。

为了探究ECS1和ECS2的功能，作者利用T-DNA突变体构建了ecs1/2的双突（单突无育性缺陷），发现多花粉管进入的比例约为10%，这可以被ECS1或是ECS2所回补，为了进一步探索配子融合的过程有无缺陷，利用精细胞的marker授粉双突，发现并无明显融合缺陷，但是在受精4-6h后能够检测到约16%的胚珠中会出现多对精细胞的现象，进一步暗示多花粉管阻碍出现问题。

Egg cell-specific ECS1 and ECS2 act together to prevent polytubey inArabidopsis

为了进一步详细分析ECS1/2的分泌与多花粉阻碍的关系，利用多个marker进行探索，可以发现在未受精前ECS1/2-mCit主要在卵细胞膜顶部极性定位，但是在受精后，信号能够弥散至降解的助细胞处。随后利用gcs-1受精缺陷的突变体，证明只有受精后能够启动ECS1/2扩散的过程，而利用一个频繁发生单受精的突变体gex2，发现ECS1/2的扩散不依赖于精细胞与中央细胞的融合而依赖精卵的融合。而截短形式（缺乏信号肽）的ECS1/2在受精不能被释放出卵细胞，说明ECS1/2的分泌活性对于功能至关重要。

ECS proteins are secreted from the egg cell after successful sperm–egg cell fusion

那么ECS1/2是如何实现对多花粉管的阻碍的呢？结合ECS弥散的位置，作者猜测很可能会作用于花粉管吸引物质。通过pull-down实验作者确认了ECS1/2与AtLURE1.2的互作，进一步通过烟草以及哺乳细胞的共表达，发现ECS1/2会特异性降解Atlure1.2。

The LURE1.2 pollen tube attractant is a direct target and substrateof ECS1 and ECS2 endopeptidases

为了确定ECS1/2切割的底物，作者体外合成了Atlure1.2的8个肽段，substrates 3, 5 和 7能够被剪切，有趣的是底物3在AtLURE1.1-5非常保守，但是在1.7-1.8以及XIUQIUs中不存在。为了在体内证明ECS1/2与AtLURE1s之间的关系，在ecs1/2 中发现AtLURE1的表达在受精后并不如WT中一样减少。因此ECS1/2对于AtLURE1s在受精后的降解至关重要。

ECS1 and ECS2 endopeptidases interact with LURE1.2 and cleave it as a substrate

为了证明ECS1/2-AtLURE1s的信号通路对于防止多花粉管进入胚珠过程的重要性，将ECS1/2异位表达在助细胞，发现AtLURE1的表达降低，花粉管的吸引出现异常（类似于atlure1s），此外如果异位表达截短的ECS1/2或是卵细胞特异表达的subtilisin-like protease SBT4.13对于表型无影响。最后为了突出内切酶活性对于功能的影响，通过体外将酶活突变的ECS1/2与AtLURE1的肽段孵育或是在ecs1/2回补酶活突变的ECS1均无作用，说明了酶活对功能的重要性。

Mutation of active sites of ECS1 and ECS2 endopeptidases leads to polytubey

综上所述，本文发现了两个卵细胞特异表达的天冬氨酸蛋白酶ECS1/2，在受精后释放能够特异性降解花粉的吸引物质，实现对多花粉管阻碍的快反应。

有些问题：

1.ecs1/2 是否败育。

2.ploytubey的表型过弱（不到20%）

3.什么信号触发ECS1/2的分泌。