EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling
molecular cell 15.584
思路
H3K4me1和H3K27ac chip-seq 发现EGFRvIII突变导致SOX9和FOXG1的上调
→EGFR抑制剂可以降低SOX9和FOXG1的表达→EGFRvIII在多种细胞系中上调了SOX9和FOXG1蛋白和mRNA水平→探讨了突变型、野生型、EGFRvIII对SOX9和FOXG1的影响→敲降EGFRvIII显著降低SOX9和FOXG1的水平→EGFRvIII对SOX9和FOXG1的影响依赖于激酶发挥作用
→chip-QPCR证明了SOX9和FOXG1与EGFRvIII的反应性增强子结合。
→SOX和FOX TF家系中，SOX9和FOXG1的表达与EGFR的表达相关性最高
→一个单独数据集中，那些携带EGFR扩增和突变的BMS中，SOX9和FOXG1表达显著升高
→A random forest classifier，生长因子受体的基因改变准确预测了GBM临床样本中的SOX9节FOXG1的水平
→免疫组织化学分析显示磷酸化EGFR、SOX9和FOXG1蛋白之间存在显著相关性，所有这些蛋白都相互关联，并与Ki67染色测定的肿瘤细胞增殖率相关
→泛癌分析，SOX9和FOXG1的升高与多种癌症中各种生长因子受体的扩增有关
→chip-seq，证明EGFRvIII突变和EGFR扩增上调的enhancer在SOX和FOX 的TFs家族显著富集。
→SOX9和FOXG1体内外功能试验
→shSOX9和FOXG1的RNA-seq 差异交集的功能富集试验 腹肌到了c-MYC及EGFR相关通路
→c-MYC 被BRD4调控，且BRD4与SOX9和FOCG1显著相关在TCGA中，
敲降BRD4和bromodomain small molecule inhibitor JQ1 显著降低c-MYC的水平→EGFRvIII通过SOX9和FOXG1使GBM细胞对JQ1诱导的细胞死亡敏感
SUMMARY
①表皮生长因子受体（EGFR）基因扩增和突变是胶质母细胞瘤（GBM）中最常见的致癌事件，但其促进侵袭性肿瘤生长的机制尚不清楚。
②通过对细胞系、基因型临床样本和TCGAdata的表观基因组和转录组分析，我们表明EGFR突变重塑了GBM激活的增强子景观，通过体外和体内ASOX9和FOXG1依赖的转录调控网络促进肿瘤的发生。
③最常见的EGFR突变，EGFRvIII，使GBM细胞对BET-溴多巴胺抑制剂JQ1敏感，以一种 SOX9和FOXG1依赖的方式。这些结果确定了转录/表观遗传重塑在EGFR依赖性病理发生中的作用，并为表观治疗提供了机制基础。
Introduction
①生长因子受体在癌症中经常被扩增和/或突变。EGFR突变调控转录因子并改变癌细胞的表观结构以重编程转录的机制尚不清楚。
②EGFR在高达60%的GBM中扩增和/或突变，通过持续激活信号网络和代谢重编程促进肿瘤生长和存活
Result
1、EGFRvIII诱导染色质景观的综合分析
①我们分析了组蛋白H3赖氨酸4单甲基化（H3K4me1）和组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）与稳定的活性enhancers有关；该分析揭示了在表达EGFRvIII的GBM细胞中特异性激活的2245个假定的增强因子（图1A）。该分析揭示了在表达EGFRvIII的GBM细胞中特异性激活的2245个假定的增强因子（图1A）。血清的加入并没有改变这些促进剂的激活状态，血清中含有可以激活其他细胞表面受体的生长因子（图1A）。
②为了深入了解这些假定的增强子可能调控的EGFRvIII特异性转录的调控，我们进行了RNA序列分析（图1B）。H3K4me1和H3K27ac芯片序列鉴定的EGFRvIII激活的en-hancer在EGFRvIII上调转录物附近显著富集，表明存在一个协调的、EGFRvIII调控的转录网络（图1C）。
③对EGFRvIII激活增强子内TF识别基序的分析表明，在表达EGFRvIII的GBM细胞中上调的41个TF中，许多TF的结合位点高度富集（图S1A）。特别是，TFs的FOX和SOX家族的基序是最丰富的基序之一（图1D）。
④SOX9和FOXG1转录本与大脑发育有关，并被认为在癌症中发挥作用，它们都被EGFRvIII表达高度升高（图1B）。因此，我们着手确定EGFRVIII是否调控了SOx9和FoxG1的表达，并研究其功能重要性。
2、EGFRvIII激活sox9和foxg1的转录
①在用EGFR酪氨酸激酶抑制剂雷洛替尼处理的GBM细胞中，我们检测到在SOX9和FOXG1附近的特异性增强子处H3K27ac显著减少（图2A）
②在FOXG1附近的erlotinib敏感H3K27ac峰与FOXG1启动子形成长程chromatin环，如环状染色体确认捕获（4C-seq）实验所证明，支持其作为FOXG1增强子的作用（图S2A）。
③我们检测了EGFRvIII对多种GBM细胞系中SOx9和FoxG1mRNA和蛋白质水平的影响。在U87 GBM细胞中，EGFRvIII表达显著增加了SOx9和FoxG1转录物和蛋白质水平（图1B和2b），这被厄洛替尼抑制（图S2B）。
④mTOR激酶抑制剂torin1和MEK抑制剂U0126也降低了SOX9和FOXG1水平，表明EGFRvIII通过下游信号控制这些TFs的表达（图S2B和S2C）。为了确定野生型EGFR和突变型EGFR、EGFRvIII是否对SOX9和FOXG1有不同的调节作用，我们构建了一个靶向EGFR exon 9的小干扰（si）RNA构建体，该基因敲除了野生型EGFR和EGFRvIII，并构建了靶向EGFRvIII中缺失的外显exon 2的siRNA构建体，它只能击倒野生型EGFR表达（图2C）。
⑤如图2D所示，敲除EGFRviii，而非仅敲除野生型EGFR，导致SOX9和FOXG1转录水平显著降低。为了测试EGFRvIII对SOx9和FoxG1的作用是否依赖于其激酶活性，我们引入了一种激酶死亡的EGFRvIII构建体
⑥在U87 GBM细胞中，EGFRvIII（而非激酶死亡的EGFRvIII）以厄洛替尼敏感的方式显著升高SOX9和FoxG1转录水平（图2F），表明：（1）观察到的EGFRvIII对SOx9和FoxG1转录的影响不是由于外源性EGFRvIII的表达，EGFRvIII对SOX9和FOXG1表达的影响依赖于EGFRvIII激酶活性。为了证实EGFRvIII在不同GBM细胞系中的作用，我们在LN229 GBM细胞中用强力霉素诱导启动子控制表达EGFRvIII，在U373GBM细胞中用强力霉素抑制启动子控制表达EGFRvIII。EGFRvIII在两种细胞系中均能上调SOX9和FOXG1蛋白的表达（图2G）。
⑦厄洛替尼治疗大大降低了GBM6细胞中SOX9和FOXG1蛋白的表达，表明内源性表达的EGFRvIII在非工程细胞中也通过其激酶活性调节SOX9和FOXG1（图2H和2I）。
3、SOX9和FOXG1与EGFRvIII应答增强子相互作用
为了确定SOX9和FOXG1是否与EGFRvIII反应性增强子结合，我们在两个信息基因FoxF1和Tfap2C上用q-PCR，使用针对SOX9和FOXG1的抗体。我们关注这两个基因是因为：（1）它们是EGFRvIII反应性增强子附近的基因（由H3K27Ac和H3K4me1定义，在U87EGFRvIII细胞中这些基因附近的增强子非常高，在87细胞中沉默），（2）它们的表达被EGFRvIII的表达大大提高，SOX9或FOXG1基因敲除使其mRNA表达消失表达式.As如图3A所示，SOX9和FOX1都与这两种受EGFR调控的增强因子结合基因。而且，我们对SOX9和FOXG1基因座进行了chip-qPCR，证明SOX9和FOXG1都与可能调控它们的增强子结合，从而为自动调节提供了有力的证据（图3B和3C）。仔细观察芯片qPCR数据表明，FOXG1可能也交叉调节SOX9。FOXG1基因敲除降低了SOX9转录物和蛋白质水平，反之亦然，提高了更复杂形式交叉调节的可能性（图S3a和S3B
4、SOX9和FOXG1与临床GBM样本中的EGF扩增/突变相关
①TCGA--在相对较大的HMG/SOX和FOX TF家系中，SOX9和FOXG1的表达与EGFR的表达相关性最高（p值/FOXG1=1.27310-18；p值/SOX9=1.10310-41，Matlab相关函数；图4A、S4A和S4B）。
②在一个单独的TCGA数据集中，使用169个GBM肿瘤样本的RNA序列图谱（Brennan等人，2013），在那些携带EGFR扩增和突变的BMS中，SOX9和FOXG1表达显著升高，包括EGFRVIII（pFOXG1<0.0038；pSOX9<0.0017，Wilcoxon；图4B和S4D）。
③一个随机森林分类器证明（A random forest classifier），生长因子受体的基因改变准确预测了GBM临床样本中的SOX9（曲线下面积[AUC]=0.94，p=2.3310 � 15，Z检验）和FOXG1（AUC=0.83，p<131015，Z检验）的水平，这主要是由EGFR的基因改变驱动的（图4C、S4E和S4F）
④此外，FGFR3过度表达与基因扩增和/或突变相关（Parkeret al.，2013；Singh et al.，2012），与TCGA临床GBM样本中SOX9水平升高相关。配体诱导的DFGFR3活化增加了体外SOX9水平（图S4E和S4G）。
⑤结合显示EGFRvIII促进Sox9和FoxG1（图2）的机制数据，这些结果表明GBM中基因改变与Sox9和FoxG1表达之间有很强的关联，以FGFR3和Sox9之间的关联。在蛋白质水平上也证实了这种联系。GBM组织微阵列的免疫组织化学分析显示磷酸化EGFR、SOX9和FOXG1蛋白之间存在显著相关性，所有这些蛋白都相互关联，并与Ki67染色测定的肿瘤细胞增殖率相关（图4G–4I）。
⑥对其他肿瘤类型的TCGA数据的分析也表明，SOX9和FOXG1的升高与多种癌症中各种生长因子受体的扩增有关（图S4H和S4I；表S1），表明SOX9和FOXG1可能是多种癌症类型中生长因子变下游的共同转录效应物。
⑦这包括四个具有EGFR扩增和EGFRvIII模拟的GBMs和两个具有升高的FGFR3转录表达的GBMs（图S4J）。
⑧我们还对一例无受体酪氨酸激酶（RTK）突变的低级别胶质瘤进行了H3K4me1和H3K27ac芯片序列分析，但含有NIDH132H突变（表2），通过比较，我们获得了6个不同正常脑区的H3K27ac芯片序列。在GBMs中检测到两组不同的生长因子相关增强子，这些假定的EGFR/FGFR3激活的增强子在TFs的SOX和Fox家族的结合序列基序中显著富集（图4e），并且位于NEGFRviii+和GFREuploidGBMS之间差异表达的基因附近（图4D）4F）。综上所述，这些结果表明在临床GBM样本中RTK基因改变下游存在协同转录程序和表观遗传重构。
5、SOX9和FOXG1在体内外促进GBM
①为了确定SOX9和FOXG1在EGFR vIII依赖性肿瘤生长中的功能作用，我们产生了稳定表达短发夹（sh）RNA的GBM细胞，靶向SOX9和FOXG1，并进行了芯片序列分析，以确定这些敲除对EGFRvIII反应性增强子激活状态的影响。击倒任一TF显著降低EGFRvIII响应性增强子的H3K27乙酰化和H3K4单甲基化（图5A和5B）。
②此外，SOX9或FOXG1的敲除严重损害了培养物中U87EGFRvIII细胞的生长，并且几乎完全阻断了软琼脂中的集落形成（图5C和S5a-S5C）。在体内，SOX9orFoxG1基因敲除导致携带SOX9orFoxG1基因敲除肿瘤的小鼠肿瘤发展明显延迟，肿瘤大小显著减小，这与显著延长生存期有关（图5D-5F和S5d-S5L）。
③为了确定由SOx9和FOXG1控制的整体转录序列，我们对有或没有shRNA敲除SOx9orFoxG1的87EGFRVIII细胞进行了RNA序列分析。该分析鉴定了993个和1920个基因，它们的表达分别被SOx9和FoxG1基因敲除显著降低，包括376个受两种TFs调控的基因（图5G）。这376个基因在与胶质瘤和其他癌症类型相关的基因本体中高度过表达，表明潜在的重要致癌功能（图5H）。总之，这些结果表明SOX9和FOXG1协同控制GBM中EGFRvIII调控基因的一个子集
④为了确定由SOx9或FOXG1调控的可操作的转录程序，我们对SOx9/FOXG1敲除细胞的转录组进行了基因集富集分析（GSEA）。该分析表明先前鉴定的c-MYC靶基因和EGFR调节基因显著富集（图5I），表明SOX9和FOXG1相关基因在促进EGFR依赖的肿瘤细胞生长中发挥作用。
6、EGFRvIII通过SOX9和FOXG1使GBM细胞对JQ1诱导的细胞死亡敏感
①c-MYC的表达及其靶基因的转录由BRD4调节，BRD4是BET蛋白家族成员，作为一种转录辅助因子（Shi和Vakoc，2014）。值得注意的是，在BET家族成员中，BRD4转录水平与GBMs的TCGA数据库中的SOX9和FOXG1的水平显著相关（图6A和6B）。BRD4转录在富含外源性遗传改变的经典GBM亚型中也显著增加（图6C）。
②BRD4击倒或用pan BET--溴吗啉小分子抑制剂JQ1治疗显著降低c-MYC水平（图6D、6E和s6a）。
③有趣的是，sox9orfoxg1基因敲除显著降低了U87EGFRvIII-GBM细胞中BRD4和c-MYC蛋白水平（图6Fand 6G）。综上所述，这些结果表明，EGFR vIII通过SOX9和FOXG1介导的BRD4调节来控制c-MYC水平，这与最近的证据一致，即c-MYC对EGFRvIII依赖性肿瘤的发生至关重要（Babicet al.，2013；Masui et al.，2013
④最近的研究表明，JQ1能有效抑制某些癌症的生长，这些癌症依赖于扩增转录来维持其致癌状态（Lin等人，2012；Lovénet等人，2013）。因此，我们询问EGFRvIII是否使gbms对JQ1敏感，这是否通过sox9和FOXG1转录网络介导。⑤在U87 GBM细胞中，EGFRvIII的存在显著增加了对JQ1的凋亡素反应量（图6H和S6B）。靶向Ox9、FOXG1或Rd4的shRNA均逆转了EGFRvIII依赖性对JQ1的视敏感性（图6H），表明表达EGFRvIII的GBM细胞对JQ1的凋亡反应增强，JQ1由SOx9和FOXG1介导，并且是BRD4依赖性的。
⑥对JQ1高反应性是因为EGFR III激酶活化的原因，因为JQ1诱导的细胞死亡水平存在差异，表达激酶死亡EGFR III的细胞数为U87 GBM细胞（图6I）。EGFRⅢ对GBM细胞对JQ1的敏感性作用也在LN229和U373 GBM细胞中观察，其中EGFR III在强力霉素可调节启动子（LN229tet-on和U373-tet-off控制下）控制下（图6J和6K）。
⑦为了进一步证实这些发现，我们应用活细胞激活的caspase-3/7成像分析来评估JQ1介导的凋亡是否与caspase激活和/或EGFRvIII激酶活性增加相关。通过这种方法，JQ1对U87细胞的作用很小。相反，JQ1治疗引起U87 EGFRvIII和激酶死亡的EGFRvIII细胞中半胱氨酸蛋白酶活性水平的剂量依赖性增加。然而，JQ1对U87 EGFRvIII细胞的作用浓度明显低于那些表达无催化活性突变体的细胞（图7A、7B和S6C）。因此，JQ1对细胞死亡的影响可能是半胱天冬酶依赖性的，并通过EGFRvIII激酶活性显著增强。此外，携带内源性EGFR扩增和EGFRvIII突变的患者源性神经球细胞系GBM6对JQ1诱导的细胞死亡敏感，其生存能力依赖于SOX9和FOXG1的表达（图7C）
⑧最后，我们在小鼠异种移植模型中研究了JQ1（高度脑渗透剂）（图S7）对大脑中U87 EGFRvIII GBM生长的影响。JQ1以50 mg/kg的剂量每日两次经口灌胃给药可显著降低颅内肿瘤生长（图7D）
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chip-qPCR 详解