2021-06-08 GFP发光原理及发光特性

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白GFP的发现

绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，简称GFP）是在美国西北海岸所盛产的一种名为Aequorea victoria的水母中发现的一种可以发出绿色荧光的蛋白质。GFP最早是在1962年由日本科学家下村修发现，是由238氨基酸组成的单体蛋白质，蛋白分子量约为27kD。GFP的晶体结构显示，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于桶的大空腔内。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性，去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸，GFP均会失去荧光。原因是GFP生色团的形成效率较低，而且形成过程受外界环境影响较大。

绿色荧光蛋白GFP的应用

绿色荧光蛋白GFP在分子生物学上的应用

绿色荧光蛋白GFP作为报告基因

绿色荧光蛋白GFP作为融合标签

作为生物传感器

检测pH

检测卤素离子

绿色荧光蛋白GFP在细胞生物学上的应用

绿色荧光蛋白GFP用于细胞的筛选

绿色荧光蛋白GFP用于药物的筛选

绿色荧光蛋白GFP的发光原理

GFP的第65至67位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）残基，可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”，导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下，发色团可进一步发生氧化脱氢，最终成熟，形成可发射荧光的形式。具体过程为：在 O2存在下，GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光，中度氧化剂如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

绿色荧光蛋白GFP的发光特性

GFP吸收的光谱更大峰值为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副吸收峰（蓝光）；发射光谱更大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder）。虽然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害更小，因此通常多使用该波段光源（多为488nm）。此外，GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐（FITC）很相似，两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素强，特别是在450～490nm蓝光波长下更稳定。类似的，GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白，比如萤火虫荧光素酶等。

相关GFP的变体

在GFP发现的半个世纪中，陆续衍生了多个变体，其中最的要属其红移变体——增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP，EGFP；EGFP的更大吸收峰位于488nm）。其他还包括发射荧光也发生改变的变体，包括蓝色荧光蛋白：EBFP，EBFP2，Azurite，mKalama；青色荧光蛋白：ECFP，Cerulean，CyPet；黄色荧光蛋白：YFP，Citrine，Venus，YPet等等。

https://wiki.antpedia.com/danbaizhideyingguangjifabochangruhexuanze-2352666-news

蛋白质的荧光激发波长如何选择？