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在人类肿瘤中基因突变研究已大大改变了癌症的治疗方法，靶向治疗最成功的例子之一是TKI（酪氨酸激酶抑制剂），作为一线治疗在EGFR突变的NSCLC（非小细胞肺癌）患者中的应用。尽管大多数患者能够对靶向治疗表现出良好的初始反应，但他们经常会产生耐药性。接下来介绍的这篇研究在单细胞分辨率下观察NSCLC细胞群体内药物耐受状态，寻找预后和治疗分子靶标。题为Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer，于2021年3月份在Nature communications（IF= 12.121）上发表。
数据：
主要围绕单细胞测序数据，包括NSCLC的 PC9、HCC827、H1975 细胞系，白血病U937细胞系，黑色素瘤 M14 细胞系，3个NSCLC患者的肿瘤组织。（给大家安利一下CCLE数据库，网址 https://portals.broadinstitute.org/ccle，囊括了各种癌症细胞系的组学测序数据和用药信息，虽然本文作者是用自己的细胞系样本测序，但对于想空手套白狼的小编来说拿来上手生信分析再合适不过了。）
结果一：埃罗替尼处理的PC9细胞的耐药状态发现
在埃罗替尼（一种TKI）处理之后，PC9细胞（一种NSCLC细胞系）生存率迅速下降，之后又缓慢上升，在各个时间点取样进行Drop-seq观察细胞的转录组变化，总共进行848个药物处理的PC9细胞和756个对照细胞。通过UMAP分析发现细胞亚群聚类基本按照收集的时间顺序，在去除细胞周期的影响之后仍然得到相似的聚类结果。根据聚类结果以及样本收集时间，将产生药物耐受性的细胞划分为drug-tolerant persisters (DTPs) 和drug-tolerant expanded persisters (DTEPs)，其中DTPs是在药物处理的早期，DTEPs则是在药物处理之后细胞又重新开始扩张生长的时期。通过差异表达分析识别了62个DT markers，并使用单分子RNA原位杂交技术和免疫荧光技术验证了NEAT1等基因。（见Figure 1）
Figure 1
结果二：药物耐受状态的可逆性
在埃罗替尼处理之后细胞出现药物耐受性，那么停药一段时间后再给药（称之为药物假日或休药期drug holiday）之后细胞又会有什么样的变化呢？带着这个问题作者在药物处理11天后，在接下来6天内停止给药，在第17天时将细胞分为重新给药组、对照组，重新给药组按原剂量给药2天。在第0、2、11、19天时取样测序，聚类结果发现休药期之后重新给药的细胞与休药期之前的细胞具有很高的重叠，反映了转录组相似性，而19天时仍处于休药期的细胞则聚类独自成为亚群。此外，重新给药的细胞Marker的表达也重新呈现出休药期之前的状态。作者认为，药物耐受的可逆性与DT markers的可逆性表达相关。（见Figure 2）
Figure 2
结果三：识别与EGFR-TKI（埃罗替尼）抵抗亚群相关的基因
之前的结果均是在NSCLC PC9细胞系中观察到的，作者进一步在NSCLC HCC827细胞系和黑色素瘤 M14 细胞系中进行分析，分别在各个细胞系中进行药物处理，聚类分析识别药物耐受亚群，差异表达分析结合功能富集分析识别与药物耐受相关的生物学功能。在四个模型中，有一些共同的基因，涉及到EMT、组织发育、囊泡介导的物质转运和表观调控。（见Figure 3）
Figure 3
作者认为上述涉及到药物耐受相关的功能是分布在不同亚群之间，而不是在某个亚群中共同出现的。通过10X技术捕获的两个PC9样本的细胞分析发现，这两个样本药物抵抗群体分别存在不同的差异表达基因和显著上调空路，揭示了两个药物抵抗群体可能具有不同的药物抵抗机制。（见Figure 4）
Figure 4
结果四：选择靶向DT markers的抑制剂
既然DT markers的表达与细胞耐药相关，并且在耐药可逆性过程中呈现出关联性，那么是否存在单个或多个marker使得抑制其表达就足以抑制细胞耐药性呢？借助于LINCS数据库中15种癌症细胞系和268种小分子抑制剂的信息，结合MsigDB数据库中药物耐受状态相关的signature，作者成功筛选到显著改变的基因和小分子药物，克唑替尼、南蛇藤醇和GSK1059615可以作为EGFR TKI（埃罗替尼）的联合应用药物。（见Figure 5）
Figure 5
作者在PC9细胞系中联合应用埃罗替尼、南蛇藤醇和克唑替尼等药物，发现南蛇藤醇可以专门针对克唑替尼耐受的细胞，药物组合可能在靶向耐药的细胞过程中有效，此外，发现克唑替尼耐受的细胞是埃罗替尼耐受细胞的一个亚群。（见Figure 6）
Figure 6
在另外一组联合用药分析中，发现克唑替尼可以抑制奥西替尼耐受群体的出现，也就是说药物联合治疗可能通过下调特定的生存机制来减少细胞群的异质性。（见Figure 7）
Figure 7
结果五：在NSCLC病人样本中观察药物耐受marker
细胞系研究终究是细胞水平，一切生物医学研究的关键在于如何直接或间接应用到改善临床患者的处境上面来。作者在127个携带有EGFR突变的NSCLC患者中，使用芯片数据观察DT markers的表达情况，具有较高DT markers Z score的患者具有较差的临床预后，暗示了与药物抵抗过程有关。此外，对额外的NSCLC原位瘤的单细胞测序结果揭示了药物敏感性相关的癌症细胞亚群，这对于患者的治疗是一个潜在的福音。（见Figure 8）
Figure 8
文末小结：
在这项研究中，为了更好地理解单个细胞对药物治疗的反应差异，作者使用单细胞分析方法在已建立的对TKI有反应的NSCLC模型中进行研究，揭示了在治疗过程中NSCLC细胞系模型产生耐药性的机制，涉及在细胞群体内共存并表达不同组合标志物的药物耐受状态，所述标志物最终可以用作小分子疗法的预后或治疗靶标。
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