细胞培养基本操作

笔者最近在培养人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)，记录一下细胞培养的一些基本操作。

细胞传代：

从37°C含5%CO2的培养箱中拿出细胞培养瓶，首先观察培养瓶内的液体是否混浊（混浊说明细胞可能被污染），然后镜下观察细胞生长情况，当细胞长满70%以上时，可以传代。

25ml培养瓶内加入3ml PBS清洗两次，之后加入0.5ml胰酶（实验室用的仙人掌胰酶比较温和），放入培养箱消化3-5min（要确保细胞被消化下来），加入2ml培养基（ECM）终止消化。将液体收集到离心管，350g 离心5min（这样才能沉淀细胞），之后去上清，向离心管加入6ml ECM，吹匀细胞（吹成单个细胞），向三个25ml培养瓶分别加2ml，之后在向培养瓶内补培养基到6ml。

细胞冻存：

25ml培养瓶内的细胞长满后，用3ml PBS清洗两次，胰酶消化离心之后，弃上清，加入4.5ml培养基和500μl DMSO （10%），吹匀细胞后分装到5个冻存管，每个1ml，放入-80冻存。

细胞复苏：

冻存的细胞从-80或者液氮拿出来后，立即放到37°C的温水中（注意冻存管内是否漏入液氮），融化之后，350g 离心5min，弃上清，加入1ml ECM，吹匀细胞，加入25ml培养瓶，并补齐ECM到6ml。

注意：

一.培养瓶在盖盖子时要过酒精灯，并且培养瓶的盖子不能拧紧；

二.75ml培养瓶是10ml培养体系，加1.5ml胰酶消化，加4倍量培养基终止消化；6孔板是2.5ml培养体系（0.3ml胰酶消化），12孔板是2ml培养体系（0.1ml胰酶消化），24孔板是1ml培养体系（0.1ml胰酶消化），96孔板是100μl培养体系（1滴胰酶消化）。加完胰酶要轻微晃动培养瓶或培养板，使胰酶能够覆盖贴壁细胞；

三.清洗所用的PBS的量，是培养基量的一半；

四.25ml培养瓶长满细胞大约有个细胞；

五.HUVEC传到第4代后就不能用了。