陈巍学基因视频学习笔记--视频11:单细胞mRNA测序

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单细胞mRNA遇到的困难:

(1)单细胞mRNA的量非常少,只有0.2 pg,需要的扩增倍数非常大,很难控制均已覆盖;
(2)建库的时候如何尽可能的扩增mRNA,尽量减少其他RNA的干扰。

解决问题:

1. SMART

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详细介绍


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之后就是常规的建库即可
方法的巧妙点:
(1)定位引物,保证逆转录的位置,合成出来的cDNA之后连上通用引物;
(2)利用MMLV逆转录酶加C碱基的作用,再用有3个碱基的上游引物进行第二链的合成,保证了只有完整的第一链cDNA才能被合成出cDNA的第二链,保证了双链cDNA是全长的;
(3)保证PCR扩增的一致性,因为cDNA的5’和3’都引入了一样的引物,从而保证了PCR扩增效率的一致性。
建库测序情况如下


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2. TargetAmp

第一链cDNA


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第二链cDNA


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巧妙之处:
不用PCR,用转录的方法得到文库,统一T7启动子,保证了扩增效率的均一性,一方面保证了量,另一方面保证了扩增效率的一致性。

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