2020-10-23 检材DNA的提取 ＆ 测序知识

检材DNA的提取

• 基本步骤

1. 在弱碱和有螯合剂存在的条件下，进行组织匀浆、溶解细胞膜和核膜。
2. 在去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）和蛋白酶K的作用下消化蛋白质，游离出DNA。（去垢剂和蛋白酶作用使DNA和组蛋白分离，DNA分子逐步伸展、缓慢溶解，溶液变得粘稠）
3. 有机溶剂（常用酚和氯仿混合物）萃取DNA，除去残余蛋白、脂质、糖及细胞杂质等成分。经离心后，有机溶剂留在下层，含DNA的水相在上层，变性蛋白则在两者之间。萃取后可对DNA再进行一次透析，提高DNA的纯度。
4. 最后，取上层水相，用乙醇沉淀DNA，获得以乳白色丝状沉淀物状态出现的DNA。

注意：
a. 操作动作要温和；保持碱性条件并使用螯合剂EDTA，可有效抑制核酸酶，以保护DNA分子的完整性。
b. 精子DNA由鱼精蛋白包装，精细胞外膜含丰富的硫醇蛋白二硫交联网状结构，能抵抗去污剂和蛋白酶。因此精子DNA的提取比较特殊，除使用SDS和蛋白酶K之外，还应同时加入还原剂二硫苏糖醇（DTT）。

• 新鲜血液标本DNA提取方法

1. 取EDTA抗凝血3mL，置于10mL试管中，加入等体积2×蔗糖-TritonX-100缓冲液，颠倒混匀至液体透明。
2. 3000rpm离心15min，去上清，留沉淀。
3. 将沉淀物移入匀浆器中，加0.5mL EDTA·Na2溶液，匀浆。
4. 匀浆液移至10mL试管中，加入1/10体积的10% SDS和蛋白酶K 75μL（终浓度100μg/mL），缓慢转动混匀。
5. 37℃水浴4~6h。
6. 加入等体积（1.5mL）饱和酚，缓慢混匀5min。
7. 3000rpm离心10min，取上层水相，移至另一试管中。
8. 1：1酚和氯仿1.5mL提取1次，重复步骤7。
9. 加等体积（1.5mL）氯仿混匀5min，3000rpm离心10min，将上层水相移至小烧杯内。
10. 加NaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加2.5倍体积冷无水乙醇，混匀，得到团块状DNA沉淀。
11. 将DNA沉淀移至1.5mL的Ep管中，加1mL 70%乙醇漂洗，8000rpm离心5min，弃上清，保留DNA沉淀，置于真空干燥器中干燥15min。
12. 加适量TE缓冲液溶解，4℃保存备用。

测序知识

一代测序【Sanger测序，又称为SBS法（sequence by synthesis，边合成边测序）、末端终止法】

原理：
由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

二代测序【NGS ，循环阵列合成测序法】

二代测序以Illumina平台为代表，其在Sanger基础上加上了桥式PCR，克服了Sanger低通量的缺点。Illumina市场规模占到75%以上，主打Hiseq。
Illumina循环SBS法(cycle SBS)，即SBRT(Sequencing By Reversible Termination，可逆终止)，概括来讲就是基于可逆终止的、荧光标记dNTP来做边合成边测序的工作。其核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。

1. Flowcell（流动池）
一个flowcell含有8条lane，lane的内表面做了专门的化学修饰（主要是把2种DNA引物“种”在玻璃表面，这两种DNA引物序列和接下来需要测序的DNA文库两端的接头序列是互补的，而且这两种DNA引物是通过共价键连到flowcell上的）

2. DNA Library（DNA文库）
所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头序列，形成的DNA混合物。

• 特点：
  DNA文库有2个特点：①中间这一段插入的DNA，其序列是多种多样的；②它两头的接头序列是已知的，而且是人工特地加上去的。
• DNA文库的制作

1. 首先把基因组DNA用超声波打断
2. 用酶补平两头的末端
3. 再用Klenow酶在3‘端加上一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T）
4. 然后再用连接酶把特定的接头连上去。连好了接头的DNA混合物，我们将其称为“DNA文库”。

3. 桥式PCR
这一步实际上就是把DNA文库“种”到芯片上然后进行扩增的过程。

1. 首先把DNA文库加入到芯片上。因为文库两端的DNA序列和芯片上的引物序列是互补的，所以就会产生互补杂交。
2. 形成互补杂交后，加入dNTP和聚合酶，聚合酶就会从引物开始，沿着模板链合成出一条新的DNA链。
3. 加入NaOH溶液，DNA在碱性环境下解链。最初的那条链由于不是和芯片共价连接的所以会被冲走，而新合成的那条链则能留下。
4. 然后再在液流池中加入中性液体，把碱性溶液中和掉，使环境变为中性。此时，DNA链的另外一端就会和玻璃板上的第二种引物发生互补杂交。
5. 接下来，加入dNTP和聚合酶，聚合酶就沿着第二种引物合成出一条新的链来。
6. 然后再次加碱，使DNA解链。再加中和液，再加dNTP和聚合酶，连续重复，DNA的量就会呈指数增长。
7. 接下来要把合成的双链变成可以测序的单链：先把其中一个引物上的一个特定基团切断，然后再用碱溶液洗芯片，从而把被切断了根的DNA链被冲走。
8. 再加入中性溶液，并在其中加入测序引物，开始测序。

4. 测序
在测序过程中加入的最主要的是两种东西：①带有荧光标记的dNTP，其3’末端要被叠氮基团堵住，所以一个循环只能延长一个碱基，然后就会停止；②聚合酶。
合成完之后，冲掉多余的dNTP和酶，然后放到显微镜下，进行光扫描。通过荧光素的不同颜色，根据红黄蓝绿颜色倒推新合成的碱基是哪种碱基，然后推出模板上的碱基是什么碱基。
循环完成之后，加入化学试剂将叠氮钠基团和旁边标记的荧光基团切掉，使3‘端的羟基暴露出来，接下来再加入新的dNTP和新的酶，再延长一个碱基，如此循环重复。

5. 读取Index（Barcode）
每一个样本有一个特定的接头，每种接头里面有一段特定的序列，即Index（也叫Barcode），它标记了样本的来源。
读取Index序列的步骤：

1. 用碱把测完“read 1”的序列解链掉，再加入中性液，再加入“read 2”的测序引物。这个read 2测序引物结合的位点，正好就在index的旁边。
2. 接下来进行第二轮测序，一般来说读取6~8个碱基。读取之后，我们就可以知道这段DNA来自于哪个样本。

6. 双端测序
正向测一遍，负向再测一遍，使测序的有效长度加了一倍。