DUATION THESIS: 生态环境中的小可爱_枝角类_201905于狮子山-1

摘要

枝角类是一种小型甲壳纲动物，是淡水浮游动物群落中的优势生物之一，通常被称为“水蚤”或“红虫”，隶属于节肢动物门、甲壳纲，鳃足亚纲、枝角目。在进化过程中，为了更好的保证种群延续，度过不良环境，其形成了孤雌生殖和两性生殖交替进行的特殊生殖策略。依赖于外部环境条件的性二态的发展是枝角类的一种基本现象，这使得枝角类能够适当地利用它们的生殖策略来适应外部环境的变化，孤雌生殖能使种群迅速增长，而有性生殖则产生休眠卵维持种群的生存和延续。环境因素可有效诱导枝角类发生生殖方式转化，但其可能同时还存在着内生机制的调控，是遗传与环境相互作用的结果。但至今人们对枝角类动物的生殖转化的分子机制还不了解。本项目以微型裸腹溞（Moina micrura）和隆线溞（Daphnia carinata）为研究对象，利用组学及生物信息学与分子生物学手段分析枝角类生殖转化过程中的分子表达谱，筛选出与枝角类生殖转化相关的关键调控因子。首先采用转录组与蛋白组分析微型裸腹溞孤雌溞和两性雌溞中差异表达的mRNA和其蛋白产物，然后采用转录组和miRNA组分析隆线溞雄性溞、孤雌溞和两性雌溞中差异表达的mRNA和miRNA。主要研究结果如下：

1、微型裸腹溞孤雌溞和两性雌溞中差异表达的mRNA和其蛋白产物的分析：与孤雌溞相比较，在两性雌溞中总共发现1665个差异表达基因（702个上调基因和963个下调基因）和600个差异表达蛋白质（102个上调基因和498个下调基因）。通过关联分析发现在有性生殖雌体中有31个差异基因（15个上调基因和16个下调基因）在转录组与蛋白组水平均有显著差异。同时还发现有528个差异表达蛋白与转录水平不一致，这可能是由转录后修饰或翻译调控所引起。在两性雌溞中高表达的基因和蛋白主要为球蛋白相关家族、卵黄蛋白原相关家族、表皮生长相关家族、热休克蛋白相关家族和甲基转移酶相关家族，表明这些家族蛋白可能参与了微型裸腹溞有性生殖的产生和性状维持。与之相反，孤雌生殖雌体中上调的基因和蛋白质主要与代谢过程密切相关，这可能是微型裸腹溞群体快速增长的原因。

2、隆线溞雄性溞、孤雌溞和两性雌溞中差异表达的mRNA和miRNA的分析：在mRNA表达分析中，两性雌溞与孤雌溞相比，在两性雌溞中有1127差异表达基因（657个上调基因和470个下调基因）；雄性溞与孤雌溞相比，在雄性溞中有1616个差异表达基因（914个上调基因和702个下调基因）；雄性溞与两性雌溞相比，在雄性溞中有738个差异表达基因（405个上调基因和333个下调基因）。在雄性溞和两性雌溞中高表达的基因主要属于胶原蛋白相关家族、表皮相关家族、过氧物酶相关家族和生殖相关基因，差异表达基因富集的主要功能与保护性表皮结构形成、氧气的转运和储存、性腺发育和雄性性别决定有关，主要通路与应对环境胁迫反应、表皮屏障的形成和生殖腺与卵母细胞正常发育有关。在miRNA表达分析中，获得39个保守的miRNAs和8个新的miRNA；雄性溞与孤雌溞相比，在雄性溞中有9个差异表达miRNA（4个上调和5个下调）；雄性溞与两性雌溞相比，在雄性溞中有6个差异表达基因（3个上调和3个下调）；bantam、miR-iab-4、miR-7、miR-33、miR-124和miR-252家族的miRNA可能在隆线溞生殖转化过程发挥重要作用。此外，几对miRNA-mRNA可能是调节隆线溞生殖转化生物过程（性腺发育、雄性性别决定）的功能性模块，如dpu-miR-252a—Lrp2、dpu-miR-279b—Lrp2、dpu-miR-375—Lrp2、dpu-miR-375—DapmaDsx1-a、novel-miR-6—GRIK2和novel-miR-6—Ocin01_04175调控模块。

关键词：枝角类；生殖；转录组；蛋白组；miRNA 组；

Abstract

The cladoceran, a small crustacean, is one of the dominant organisms in the community of freshwater zooplankton. It is usually called "water flea" or "blood worm" and belongs to the arthropoda, crustacea, branchiopoda and cladocerata. During its long history of evolution, Cladoceran has formed an unique mode of reproduction, as the parthenogenesis and bisexual reproduction appear alternatively in a life span. The development of sexual dimorphism that depend on external environmental conditions is a basic phenomenon of cladoceran, which enables cladoceran to properly utilize their reproductive strategies to adapt to changes in the external environment, and parthenogenesis enables populations to grow rapidly and sexual reproduction produces dormant eggs to maintain the survival and continuation of the population. The reverse of reproduction mode of cladoceran can be affected effectively by environmental cues, and closely regulated by inner molecular mechanism at the same time, as a result of mutual interaction between environment and inner regulation. However, little is known about the molecular mechanisms of reproduction switching in Cladoceran. In this project, using Monia micrura and Daphnia carinata as the model, the omics, bioinformatics and molecular biology methods were used to analyze the molecular expression profiles of cladoceratae during reproductive switching, key regulatory factors related to reproductive switching in cladoceratae were screened out. First, the differential expression of mRNA and its protein products in Monia micrura (parthenogenetic female (PF) and sexual female (SF)) were analyzed by transcriptome and proteome. Second, differential expression of mRNA and miRNA in Moina micrura (male (M), parthenogenetic female and sexual female) were analyzed by transcriptome and miRNA analysis. The main results are as follows:

1. The analysis of mRNA and its protein products differentially expressed in parthenogenetic female and sexual female of Moina micrura: A total of 1665 DEGs (702 up-regulated, 963 down-regulated) and 600 differentially expressed proteins (DEPs) (102 up-regulated, 498 down-regulated) were detected in SF. Correlation analyses indicated that 31 genes were expressed significantly differentially at both transcriptomic and proteomic levels, including 15 up-regulated genes and 16 down-regulated genes in SF. Meanwhile, our data also showed that 528 DEPs have discordant expression at transcript level, implying post-transcriptional (including translational) regulation. These top up-regulated genes and their protein products in SF were mainly grouped into the globin-related family, vitellogenin-related family, cuticle-related family, Hsp-related family and methyltransferases-related family, which were all involved in the reproductive switching in Daphnia. In contrast, a GO analysis revealed that up-regulated genes and their protein products in PF were strongly associated with the metabolic process, which may be responsible for rapid population proliferation in M. micrura.

2. The analysis of mRNA and miRNA differentially expressed in male, parthenogenetic female and sexual female of Daphnia carinata: in the mRNA expression analysis, 1127 differentially expressed genes (657 up-regulated and 470 down-regulated) were detected in SF compared with PF, 1616 differentially expressed genes (914 up-regulated and 702 down-regulated ) were detected in M compared with SF, and 738 differentially expressed genes (405 up-regulated and 333 down-regulated) were detected in M compared with PF. These genes highly expressed in male and sexual female were mainly grouped into the collagen-related family, cuticle-related family, peroxidase-related family, and reproductive-related genes. The main functions of the enrichment of differentially expressed genes were related to the formation of protective epidermal structure, the transport and storage of oxygen, gonad development and male sex determination, and the main pathways were related to the response to environmental stress, the formation of epidermal barrier and the normal development of gonads and oocytes. In the miRNA expression analysis, 39 conserved miRNAs and 8 novel miRNAs were obtained, a total of 9 differentially expressed miRNAs (4 up-regulated and 5 down-regulated) were detected in male compared tosexual female and 6 differentially expressed genes (3 up-regulated and 3 down-regulated) were detected in male compared to parthenogenetic female; the miRNAs of bantam, mir-ab-4, mir-7, mir-33, mir-124 and mir-252 family may play an important role in the reproductive switching in D. carinata. In addition, several pairs of miRNA-mRNA may be functional modules regulating the reproduction process of daphnia (gonad development and male sex determination), such as dpu-miR-252a—Lrp2, dpu-miR-279b—Lrp2, dpu-miR-375—Lrp2, dpu-miR-375—dapmadsx1-a, novel-miR-6—GRIK2 and novel-miR-6—Ocin01_04175 regulatory modules.

Keywords****: Cladoceran; Reproduction; Transcriptome; Proteome; miRNA

缩略语表

Abbreviations

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第一章 文献综述

枝角类是一种小型甲壳纲动物，是淡水浮游动物群落中的优势生物之一，通常被称为“水蚤”或“红虫”，隶属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea），鳃足亚纲（Babchiopoda）、枝角目（Cladocera）。它们最早出现在渐新纪，之后进入了大部分淡水栖息地，其身体短小，左右侧扁，呈椭圆形，体长大多数为0.2-6.0毫米（0.01-0.24英寸），其头部头朝下暴露在外，复眼正中，一个薄而透明的甲壳覆盖着明显未分割的胸腔和腹部（蒋燮治 1978）。绝大多数生活于淡水、池塘、湖泊中，是水域生态系统中的重要组成部分。

1.1 枝角类生殖模式

枝角类大多数物种的生殖方式为周期性孤雌生殖，即当外界环境条件恶化时，会从孤雌生殖(无性生殖)向有性生殖转变（图1-1）（Harris et al 2012）。当外界环境条件适宜枝角类生长时，雌性溞通常通过孤雌生殖进行繁殖，群体中通常不存在雄性个体，此时雌体产生的卵被称为称为孤雌生殖卵或夏卵。它产生的夏卵被储存在母体孵育囊中，不需受精就能迅速发育，孵育出幼溞，幼溞发育到一定程度于母体脱壳前几小时离开母体，营独立生活。通常母体蜕壳一次，就产生一胎夏卵，每胎5-10只不等。当外界环境恶化时，枝角类转而进行有性生殖，此时群体中会同时出现雄体和雌体。雄体和雌体进行交配时，雌体将卵排入孵育囊中，雄体将精子注入孵育囊并在孵育囊中完成受精过程，产生受精卵，也称冬卵。受精的冬卵通常包裹在卵鞍之中，发育到囊胚阶段，形成生殖腺与头部的原基以后，就离开母体，进入滞育期，直到周围环境条件适宜其生长时，再继续发育，孵出幼溞（Gordo et al 1994; Cao et al 2001）。依赖于外部环境条件的性二态的发展是枝角类的一种基本现象，这使得枝角类能够适当地利用它们的生殖策略来适应外部环境的变化，孤雌生殖能使其种群数量在适宜环境下迅速增长，而有性繁殖则产生休眠卵，以便在不利的环境条件下生存，并维持种群的生存和延续（Toyota et al 2016）。

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1.2 枝角类生殖转化相关研究进展

对枝角类特殊的生殖方式的研究，即从孤雌生殖转向有性生殖及雄体出现的内在规律和机理是目前众多学者的最大兴趣。目前对枝角类生殖转化的研究主要包括两方面：外部环境因素的诱导和内部蛋白或基因的调控。

1.2.1 外界环境因子对枝角类生殖转化的影响

多年的研究已经证明了枝角类生殖转化与环境因子变化密切相关，如研究发现温度、食物、光照周期、种群密度等环境因子的改变均会诱发混交雌体的产生，并且能够增加子代幼溞中雄性的比例，进而进行有性生殖（王岩等2000；曹文清等2001；秦芬2009；Olmstead and Leblanc 2010）。

1）温度和光照

温度和食物是影响枝角类生殖转化的重要因子。极端的温度(如高温或低温)通常会诱导雄性和休眠卵的产生（Gordo et al 1994）。卢芳野等研究表明低温16℃是蒙古裸腹溞由孤雌生殖到两性生殖转化最强烈的刺激因子，当升至18℃时可诱发产生休眠卵（卢芳野等 1999）；D’Abrano在研究多刺裸腹溞时认为温度的变化可能抑制其摄食，刺激分泌某种神经介质，影响后代的性别决定（D’Abramo 1980）；而大型溞不仅能在低温下产生雄体，在30℃高温下也能产生雄性，只是相对较少（邓道贵 2008）。光照周期也是影响枝角类生殖转化的重要生态因子，Stross和Hill最早观察到光照长短可以影响蚤状溞的性别，后来他们在大型溞中发现短光照是其进行有性生殖的重要因子（Stross and Hill, 1968）；缩短光周期可以诱导雄性个体的产生，增加有性雌体的比例（Baer and Ovens 1999），一般情况下需要温度或种群密度协同作用（Stross 1969a; Stross 1969b）。

2）食物和密度

食物的种类、数量和质量也是枝角类性别决定的重要因子。Arnold研究发现盔形溞在摄食难以消化的丝状硅藻时会出现大量的雄体和混交雌体（Arnold 1971）。D'Abramo发现低的食物供给会诱导多刺裸腹溞（Moina macrocopa）进行有性生殖，并认为这是由于摄食率的下降所致（D’Abramo 1980）；同样的研究在蒙古裸腹溞和大型溞中也发现较低的食物浓度会诱导雄性和休眠卵的产生（曹文清2011; 邓道贵2008）。而Banta等发现当温度适宜时，食物不足或过多都会促进长刺溞产生雄体（Banta and Brown 1929a）。种群密度也是改变枝角类生殖方式和诱导产生休眠卵的重要条件之一。通常雄体个体的比例和休眠卵的多少与种群密度之间呈正相关（Banta and Brown 1929b；张赛等 2011）。在短光照周期下，种群密度可以刺激大型溞、蚤状溞产生休眠卵（Stross and Hill 1965; Fitzsimmons and Innes 2006）。而Olmstead和LeBlanc在研究高种群密度和食物限制对大型溞雄性性别决定的独立和交互作用中观察到高种群密度和食物限制都不会独立刺激雄性性别决定，当这两个因素联合起来后就会刺激了雄性后代的产生（Olmstead and LeBlanc 2010）。在之前的研究中也发现蚤状溞种群密度的变化不会影响雄性的产生（Lnnes et al 1997）。这提示我们，枝角类生殖方式的转变可能受多种因素的协同调控并且还存在着内生机制的调控，是遗传与环境相互作用的结果。

3）其他因子

除以上因子，研究者们还发现了能够引起枝角类发生生殖转化的诸如代谢产物、化学信号、重金属、有机污染物等其他环境因子。代谢产物的积累可以诱导枝角类发生生殖转化，诱发雄性和休眠卵的产生（卢芳野和何志辉1999）。水体中的化学信号刺激如鱼类分泌物或水体变化也会引起枝角类的休眠卵的产生（Lusarczyk 1999）。此外，水体环境中的污染物如重金属、有机物污染物也能影响枝角类的生殖方式。重金属如铜、铅、汞等显著抑制大型溞的生殖（Meng et al 2008），一定浓度的有机溶剂会影响枝角类后代的性别比例，增加雄溞和两性雌溞的数量（Baer and Owens 1999; Oda et al 2005）。

1.2.2 枝角类内在因子对其生殖转化的调控作用

虽然许多情况下环境因子的变化确实能诱导枝角类发生生殖转化，但有时却也无法使其发生改变或者其处于适宜的环境时也是会出现雄性和两性雌体（Yampolsky and Yu 1992; 曹文清等 1999）。因此一些研究者认为枝角类从无性生殖转向有性生殖主要受内部因素的调控，如受自身分泌的激素诱导或几个关键基因调控，环境可能只是在外部起到了一点诱导作用。Mousseau等提出了母体将环境变化的信息传递给子代，从而子代表现出对环境变化的适应性表现型（Mousseau and Fox 1998）。众所周知，在卵母细胞成熟过程中，雄性的产生受到内分泌因素的控制，雄溞的发生可以由保幼激素类似物诱导（Olmstead and Leblanc 2003）。王金秋和曹文清等认为，在枝角类的基因库中存在着隐性基因或性别决定基因，会受到环境因子的诱导发生性别转化或性别形成（曹文清等 1999；王金秋 2000）。

生殖转化相关基因以及他们在性别分化上的影响已经在多项研究中得到阐述。性别决定通路的基因如Doublesex (Dsx), Transformer (Tra)和Chk1已经在蚤状溞和大型溞不同生殖模型（有性生殖雌溞、孤雌生殖雌溞和雄溞）中进行了研究(Kato et al 2010; Kato et al 2011; Guo et al 2015)。此外，Xu等基于EST测序分析发现VTN、VTG和HSP基因与枝角类的生殖与胚胎发育密切相关（Xu et al 2009）。Liu等的研究表明有性生殖雌溞中的衰老相关蛋白（SAP）基因的表达水平比孤雌生殖雌溞要高（Liu et al 2014a），这可能提示枝角类的周期性孤雌生殖机制与衰老过程之间有密切联系。最近，Zhang等通过转录组测序发现拟同形溞（Daphnia similoides）中几丁质和卵黄蛋白原相关基因可能在生殖转化中有非常关键的作用（Zhang et al 2016）。由于生殖转化过程的复杂性，上述这些研究都没有真正探知枝角类生殖转化的机制。

1.3 枝角类组学技术发展概况

随着生物信息学和高通量组学技术的发展，这些实验工具使科学家能够从多方面研究枝角类体内的细胞、组织和器官。基因组、转录组、蛋白组、代谢组这些工具可以分析和积累大量的数据，更有利于研究枝角类在环境刺激下表型改变的潜在的分子机制（Colbourne et al 2011; Eads et al 2007; Fröhlich et al 2009; Poynton et al 2011）。

1.3.1 枝角类基因组研究

在分子生物学和遗传学领域，基因组是指生物体的一整套DNA，包括基因（编码区）和非编码DNA（Brosius 2009）、以及线粒体DNA（Lioyd 2000）和叶绿体DNA。基因组的研究被称为基因组学，它是研究基因组的结构、功能、进化、定位和编辑的交叉学科领域。基因组学还涉及基因组测序和分析，利用高通量DNA测序与生物信息学组装和分析整个基因组的功能和结构（Culver and Labow 2002）。

随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，全基因组de novo 测序已然成为一种探究生物生物学问题的高性价比方法。完成枝角类基因组图谱的绘制，就可以从基因组水平对枝角类的生长、发育、进化、起源等问题进行研究，从而有助于对其生殖转化等生物学问题的研究。

Crease最早对蚤状溞核糖体RNA的基因间区域长度进行了研究并测定了其核糖体小亚单位rRNA基因的全部核苷酸序列，之后又完成了蚤状溞线粒体DNA全部基因组的测序分析（Crease 1993; Crease and Colbourne 1998a; Crease and Taylor 1998b; Crease 1999）。2011年，Colbourne等完成了蚤状溞的全基因组测序，其成为现存的唯一基因组信息完全公布的枝角类基因组（Colbourne et al 2011），2015年Gilbert等绘制了大型溞基因组图谱，但是可获得的信息仅有一部分（Gilbert et al 2015）。

1.3.2 枝角类转录组研究

转录组是指一个细胞或一群细胞中所有RNA分子的集合。根据特定的实验，它有时被用来指代所有的RNA，或者仅仅是mRNA。之前我们对转录组的了解在很大程度上是源自于基因预测和有限的EST证据，而现在利用新一代测序（NGS）技术（或称为RNA-seq）进行的全转录组测序拥有前所未有的灵敏度和准确度，已经揭示了从酵母菌到人类的转录组复杂景观和动态（Wilhelm and Landry 2009; Marguerat and Bahler 2010; Ozsolak and Milos 2011）。RNA-seq这种转录定量技术已经在基因注释、表达分析和转录谱分析中得到了广泛而成功的应用（Lamb et al 2011）。Eads等利用转录组学研究了蚤状溞雄性和雌性的两个生殖阶段的基因表达情况，并揭示了一些在枝角类等甲壳动物中保守的雄性偏向基因（Eads et al 2007）。最近一些研究者通过转录组技术已经在蚤状溞和拟同形溞中挖掘出了有性生殖雌溞和孤雌生殖雌溞之间的差异表达基因（Toyota et al 2015; Zhang et al 2016）。Huylmans等根据de novo转录组组装分析了盔形溞孤雌生殖雌体和雄性之间的性别偏向基因表达，发现在盔形溞体内存在性别决定和保幼激素通路的关键基因的同源物，并认为其在无性生殖向有性生殖转变中发挥重要作用，而这些同源基因在枝角类物种中高度保守（Huylmans et al 2016）。

1.3.3 枝角类蛋白组研究

蛋白质组是指基因组、细胞、组织或有机体在一定时间内表达或可以表达的全部蛋白质。它是在特定时间、特定条件下，在特定类型的细胞或有机体中表达的一组蛋白质。蛋白质组学是对蛋白质组的研究，它是一种高通量方法，用于解决基因组序列无法提供的基因功能研究，是确认基因功能的最直接方法（Ahsan et al 2008）。蛋白组学对基因组学的有效补充也为枝角类生殖转化机理的研究提供了更多新的思路。张明凤等利用蛋白组学技术研究了隆线溞孤雌溞和两性雌溞两种不同生殖状态下蛋白质表达水平的差异，发现其从孤雌生殖转化为有性生殖过程中类酸性脱氢酶（2I234）表达量变化尤为显著（Zhang et al 2006）。但是，总的来说该方面的工作还不多。

1.3.4 枝角类microRNA组研究

microRNA（缩写为miRNA）是在植物、动物和一些病毒中发现的小的非编码RNA分子（含有约22个核苷酸），其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中发挥作用（Ambros 2004; Bartel 2004）。miRNA首次是1993年在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中被鉴定（Wightman et al 1993），它能够对各种环境压力作出反应（Chen et al 2015）。近几年，研究者们已经对miRNA在动物中的影响进行了广泛的研究，例如秀丽隐杆线虫（Grad et al 2003）、老鼠（Tang et al 2012）和日本刺参（Lu et al 2014)。新一代测序（NGS）技术为鉴定复杂生物样品中的miRNA提供了前所未有的灵敏度，可以很方便确定miRNA的潜在功能和靶基因，已经有很多物种的miRNA转录组被鉴定，例如家蚕（Wu et al 2013）、绵羊（Zhang et al 2013）和瓦氏黄颡鱼（Zhang et al 2016）。而枝角类miRNA转录组的研究也引起了人们的广泛关注。Liu等利用生物信息学的方式在蚤状溞中预测了252个miRNA前体，其可能产生262个功能性miRNA（Liu et al 2013）。Ünlü等利用Illumina HiSeq 2000 NGS平台完成了大型溞表观遗传调控的miRNA鉴定（Ünlü et al 2015）。Chen等筛选出了蚤状溞在耐受镉压力下的差异表达miRNA（Chen et al 2016）。然而，目前对与枝角类生殖转化相关miRNA的鉴定与分析的研究还没有。