单细胞 RNA 测序揭示与肾透明细胞癌复发相关的巨噬细胞亚群

2021年5月27日，美国哥伦比亚大学欧文医学中心和赫伯特欧文综合癌症中心研究人员在 Cell上发表关于与肾透明细胞癌复发相关巨噬细胞亚群研究的文章，该研究采用单细胞 RNA 测序技术对 11 位未治疗的肾透明细胞癌（ccRCC）患者的肿瘤组织和癌旁组织进行测序，绘制了 ccRCC 的肿瘤免疫微环境的图谱，发现了一个与 ccRCC 复发相关的巨噬细胞亚群，为 ccRCC 的临床治疗提供了重要理论依据。

接下来小编带大家一起走进这篇文章深入了解作者的研究思路及主要结论。

研究背景

肾透明细胞癌（ccRCC）是肾癌中最常见的组织学亚型，异质性较强。虽然原发性疾病可以通过手术治疗，但约 40% 的患者经手术切除后会复发和转移，而转移性 ccRCC 的 5 年生存率为 10%，是一种致命疾病。ccRCC 是一种免疫原性的肿瘤，但调节抗肿瘤反应机制尚未完全阐明，因此构建一个全面的 ccRCC 肿瘤免疫微环境图谱，对其抗肿瘤反应机制和治疗方法是十分必要。

研究思路

研究结果

1. 绘制 ccRCC 肿瘤免疫微环境图谱

选取 11 位未治疗 ccRCC 患者的肿瘤组织和癌旁组织，消化形成单细胞悬液，流式细胞仪分选出 CD45+ 和 CD45- 细胞，分别进行单细胞 RNA 测序和质谱流式检测，数据分析绘制了 ccRCC 肿瘤免疫微环境图谱（图1）。

图1 ccRCC 肿瘤免疫微环境图谱

2. 单细胞 RNA 测序和蛋白活性分析 CD45+ 细胞亚群

作者先对 CD45+ 细胞亚群进行单细胞转录组和质谱流式分析，基于基因表达和蛋白活性对 CD45+ 细胞进行分群，主要可分为 B 细胞、 NK 细胞、 T 细胞和巨噬细胞亚群等，同时也将癌组织和癌旁组织进行不同组别的细胞分群（图2A，2B），再基于亚群差异基因和差异蛋白绘制热图（图2C，2D），找到各亚群的 marker 基因，如 CD4+ T 细胞中 IL-7R 高表达，CD8+ T 细胞高表达 CD3，单核细胞则高表达 S100A8 和 S100A9。通过比较癌组织和癌旁组织中发现，Treg、CD8+ T 细胞和巨噬细胞在肿瘤组织中占比更高，而单核细胞、B 细胞和 CD4+ T 细胞在癌旁组织中占比更高。

图2 单细胞 RNA 和蛋白活性分析 CD45+ 细胞亚群

3.  肿瘤浸润巨噬细胞亚群的特异性表达

作者进一步比较肿瘤组织和癌旁组织中差异蛋白的表达，发现在肿瘤组织中巨噬细胞高表达LILIB5 蛋白，而在 Treg 细胞中高表达 FOXP3 的蛋白（图3A）。另外通过 RNA 测序对比肿瘤浸润巨噬细胞亚群与非肿瘤巨噬细胞差异表达的基因，发现在肿瘤浸润巨噬细胞亚群中 C1QA、C1QB、C1QC、APOE 和 TREM2 显著上调（图3B）。

图3 肿瘤浸润巨噬细胞亚群的特异性表达

4.  单细胞 RNA 测序和蛋白活性分析 CD45- 细胞亚群

作者又对 CD45- 细胞进行分群，可以将 CD45- 细胞分为上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和 M2 巨噬细胞等。这些细胞亚群在肿瘤组织和癌旁组织中比例各不同，成纤维细胞和上皮细胞在肿瘤组织中占比高，而 M2 巨噬细胞则在癌旁组织中占比高。肿瘤组织中上皮细胞亚群高表达 SERPINA1 和 CD24，这些基因的高表达与 ccRCC 患者预后较差相关（图4A，4C）。

通过蛋白活性分析可以将 CD45- 细胞被分为成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和 M2 巨噬细胞，上皮细胞又被细分为了4个亚群（E1、E2、E3 和 E4），其中 E1、E3 和 E4 在肿瘤组织中比例更高，E2 在癌旁组织中占比更高（图B，4D）。

图4 单细胞 RNA 测序和蛋白活性分析 CD45- 细胞亚群

5. 肿瘤特异性巨噬细胞与 ccRCC 复发相关

为了评估肿瘤组织中特异性巨噬细胞亚群（高表达 C1QA-C、APOE 和 T REM2）的临床意义，则用 4 例术后复发患者与 4 例无复发患者的 RNA 测序和蛋白活性数据进行验证。针对肿瘤组织中特异性巨噬细胞进行 GSEA，发现复发患者的肿瘤特异性巨噬细胞信号显著富集（图6A）。另外肿瘤特异性巨噬细胞与复发时间之间也存在着很强的关联（图6B）。另外通过热图发现，在复发患者中包括标记蛋白 APOE 和 TREM2，以及其他与巨噬细胞相关蛋白（LILRB5、MERTK 和 IGF1）表达升高（图6C）。作者选择不同时间的复发和未复发患者进行 GSEA 分析，发现所有未复发患者的肿瘤巨噬细胞信号缺失，而复发患者的肿瘤巨噬细胞信号显著富集，例外是一名晚期复发（初次手术后 82 个月）（图6D）。为了验证肿瘤特异性巨噬细胞标记物与复发之间的相关性，针对157例 ccRCC 患者进行 GSEA，结果显示术后复发患者的肿瘤巨噬细胞标志物表达升高（图6E，6F），已上结果表明肿瘤组织中巨噬细胞亚群确实与患者复发相关。

图5 肿瘤特异性巨噬细胞与 ccRCC 复发相关

研究结论

通过对 11 位未治疗的肾透明细胞癌（ccRCC）病人的肿瘤组织和癌旁组织进行单细胞 RNA 测序和质谱流式检测，绘制了 ccRCC 患者的肿瘤免疫微环境图谱，且发现了一个与 ccRCC 复发高度相关的巨噬细胞亚群，以及相关的特异性标志物，为 ccRCC 的临床治疗提供了重要理论依据。

参考文献

Obradovic A, Chowdhury N, Haake SM, et al. Single-cell protein activity analysis identifies recurrence-associated renal tumor macrophages. Cell 2021 May 27;184(11) https: //doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.038.