Molecular Oncology|黑色素瘤免疫微环境+DNA甲基化

不知不觉小编的假期已经被延长到了四月，什么迎春花、丁香花、海棠花都陆陆续续的开了，却迟迟等不到复学的通知，小编真的是没想到自己竟然会有期待开学的那么一天(在家学习真的是太不方便、太考验定力啦)！有没有小伙伴一篇文章看了一周就只读了个摘要的，或者是课题卡在那进展不下去的，哈哈，那就赶快随小编来看一下这篇3月份发表在Molecular Oncology(IF：5+)杂志上的文章吧，说不定会有收获吆！

Analysis of DNA methylation patterns in the tumor immune microenvironment of metastatic melanoma

转移性黑色素瘤中免疫微环境的DNA甲基化模式

肿瘤微环境中的免疫细胞与癌症的治疗有着密切的关系，这篇文章利用免疫细胞类型特异性基因的启动子CpG甲基化，将180名转移性黑色素瘤(MM)患者分成了三组，并比较了他们的生存时间。在泛癌背景下对免疫甲基化模式的探索表明了特定的免疫微环境也可能发生在不同癌症中。

实验方法

转移性黑色素瘤的免疫细胞类型特异性CpG集合

文中使用的甲基化数据可在GEO数据库获得(GSE144487)。首先，作者通过结合已知的两个免疫细胞类型相关的基因特征，来识别黑色素瘤患者中的免疫细胞类型，获得了与30个免疫细胞亚群相关的920个基因；接下来，基于450K和EPIC平台筛选出了这些基因的启动子CpGs，经过一系列的过滤(在参考免疫细胞中差异甲基化显著的、非免疫细胞中高甲基化的、能形成gene–CpG对的)，最终保留了包含于21个免疫细胞亚群的67对gene–CpG，流程图如图1所示。此外，作者对TCGA中的其他泛癌也进行了类似的CpG筛选。

图1. 识别免疫细胞类型特异性CpGs

甲基化得分计算

文章利用基于免疫甲基化质心的方法将样本进行了分类。免疫细胞类型特异性甲基化得分，是通过将所有属于某一特定类型免疫细胞的CpGs值取中值所得。由于基因PTEN的启动子区域包含了一组复杂的CpGs，因此，作者筛选出了位于该基因启动子DNase超敏反应位点区域的CpGs，若其中10% 的CpGs超甲基化就称基因PTEN为超甲基化。

统计分析

对于数值比较，使用的是Spearman和Kendall相关性分析；两组间的比较采用Mann-Whitneyu检验/Wilcoxon秩和检验，两组以上则采用Kruskal-Wallis检验；生存分析使用了单变量和多元COX回归；这些都是在R中完成的。甲基化和基因表达得分都是通过对某一免疫细胞类型的CpGs/基因取中值得到的。

结果分析

基于CpGs的黑色素瘤聚类

作者利用筛选出的67个免疫细胞类型特异性CpGs对Lund群体进行了一致性聚类，识别出了三个免疫甲基化簇。这3个簇在免疫CpGs中的总体甲基化水平逐渐升高(图2.A)，在21种免疫细胞类型中，有19种在簇1和簇3的中值甲基化得分是显著差异的(图2.B)，central memory CD4+ T cells和effector memory CD8+ T cells之间的差异最显著。

作者对Lund群体中局部转移病例的无远处转移生存率(DMFS)和完全转移病例(DSS)的黑色素瘤特异性生存率(DSS)做了单变量Cox回归分析，发现这三种甲基化模式存在这显著差异。簇2的DMFS显著低于簇1，簇2和簇3的DSS均显著低于簇1. 

图2. 免疫甲基化与生存的关系

免疫甲基化簇的分子特征

接下来，作者分析了不同簇的甲基化水平与免疫细胞特异性基因表达之间的关联，发现二者呈负相关(图3.A)。DNA甲基化数据表明，簇1中TILs、CD3+和CD8+细胞的强局部浸润率最高，而在Lund队列中，TILs与DSS有关。此外，就CD68+和CD163+髓系细胞而言，簇1的缺失/低浸润样本少于簇3(图3.B)，簇3还显著富集了TLS(三级淋巴结构，与预后和免疫治疗相关)，这些表明DNA甲基化可以准确反映淋巴细胞和髓系细胞的肿瘤浸润情况。

 图3. 免疫甲基化簇的分子特征

免疫甲基化簇相关的免疫排斥机制

免疫甲基化簇3是弱免疫的DNA甲基化模式，而簇1则是强免疫，为了进一步探讨这一免疫差异，作者分析了127个MM患者的MITF蛋白(黑素细胞特异性转录因子)染色信息，发现簇3中有1/4的样本是阴性的，簇1中的阴性样本更少(图4.A)。然后，作者分别对MITF阳性和阴性患者做了分析，结果表明簇3中的MITF阳性样本显著富集了c-MYC基因和DNA修复相关的基因；在不同簇的MITF阳性样本中，MYC表达显著差异，且已知的免疫排斥相关基因CTNNB1、PTEN和PIK3R1在簇间的表达值也是显著差异的(图4.B-D)。对PTEN基因的突变分析，发现簇3富集了最多的突变事件，作者还观察到了TILs缺失和活跃的肿瘤之间PTEN表达的差异性。总的来说，就是作者发现了弱免疫患者中免疫排斥相关通路PI3K-Akt的上调(通过分子改变来阻断PTEN的功能)以及MITF阳性样本中MYC和CTNNB1基因的上调。

 图4. Lund群体的免疫排斥机制

其他黑色素瘤群体中免疫甲基化簇的验证

作为验证，作者利用基于甲基化的质心将TCGA中的MM群体进行了分类，结果与Lund群体类似。当用共同的质心CpGs和tSNE将Lund和TCGA群体混合时，研究发现这三个簇可以明显的区分开，但用转移状态和群体类别进行样本注释时，却未观察到这样的分隔(图5.A)。此外，基因表达得分、肿瘤突变负荷和突变模式都与Lund队列中的簇特征相同，而且TCGA中的簇3总生存率显著低于簇1(图5.B-D)。最后，作者又再次证实了免疫甲基化谱在很大程度上与转移部位无关。

 图5. 免疫甲基化聚类的验证

最后，作者又研究了免疫甲基化特征在其他实体癌中的预后意义，发现就免疫甲基化来说，不同类型的癌症可能具有相似的免疫微环境。此外，对于大多数免疫细胞类型来说，低甲基化得分与良好的预后有关，尤其是淋巴系的免疫细胞。但是，这种显著性只存在于黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌中。总的来说，基于甲基化的免疫细胞特征为几个实体瘤群体提供了一定的预后信息，尤其是黑色素瘤。

 图6. 泛癌背景下的免疫特异甲基化

好了，今天的文章就跟大家分享到这了，总的来说，他们的生信套路并没有太大的亮点，而且结果也没有多么新颖，但是作者分析的比较透彻全面，而且有几张图小编觉得大家也还是可以借鉴一下的。Have a nice day!