Pull down实验步骤
Pull down实验步骤
一、Pull down实验特点
Pull down实验是一种广泛用于检测或确认多种蛋白质之间相互作用的体外方法[1]。该方法类似于免疫共沉淀实验，使用亲和配体捕获相互作用蛋白。这两种方法的不同之处在于，免疫共沉淀使用固定抗体来捕获蛋白质复合物，而Pull down方法使用纯化和标记的蛋白质作为“诱饵”来结合任何相互作用的蛋白质[2]。
二、Pull down实验原理
该方法包括首先将标记的蛋白质(诱饵)固定在标签特异性的亲和配体上，产生亲和支持，以捕获和纯化与诱饵相互作用的其他蛋白质(猎物)。诱饵和猎物蛋白可以从多种来源获得，例如细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统和体外转录/翻译系统。一旦猎物蛋白与固定化诱饵蛋白一起孵育，可以根据亲和配体的不同，使用洗脱缓冲液洗脱相互作用复合物。每个实验都需要适当的控制来证明具有特征的相互作用不是人为的。Pull down实验后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)解析蛋白质组分，然后通过凝胶染色或western-blot检测可视化[3]。
三、参考实验步骤
3.1细胞裂解液的制备
1.将真核细胞置于细胞培养皿中，在 37℃ CO2培养箱中孵育过夜。
2.用含有目标基因的质粒和适当的转染试剂转染细胞，以获得最佳表达蛋白所需的时间（16-24h通常是一个很好的范围）。
3.将培养皿放在冰上冷却细胞，用 1倍 PBS洗涤细胞。加入2ml预冷的 PBS，用细胞刮刀收集细胞。
4．4°C，80 × g离心5分钟。
5. 用200 μL 加抗蛋白酶的RIPA 缓冲液重悬细胞。
6．在冰上孵育20分钟，每5分钟轻轻混合一次。
7. 在-80℃下储存制备的细胞。
8. 在Pull down实验之前，解冻准备好的细胞提取物。4°C, 17000 × g 离心20分钟。使用上清液作为猎物。
3.2 以细胞裂解液为猎物的Pull down试验。
1.将120 μL Ni-NTA 琼脂糖珠转移到重力流柱上。
2. 4°C, 1000 × g离心 1 min。
3.向柱中加入400 μL蒸馏水。
4. 4°C, 1000 × g离心 1 min。
5. 50 μg his 标记的蛋白(诱饵)与400 μL 平衡缓冲液混合，上样于柱上。
6.在4°C搅拌下孵育 1小时，在冰上静置10分钟。
7. 4°C, 1000 × g离心 1分钟。
8. 将 200 μL 细胞提取液与 200 μL 平衡缓冲液混合，上样于色谱柱。
9.在 4°C 搅拌下孵育 1 小时，然后在冰上静置 10 分钟。
10. 4°C, 1000 × g离心1 min。保持流动以供分析。
11. 向柱中加入400 μL平衡缓冲液洗涤柱。
12. 4°C, 1000 × g离心 1 min。
13. 向柱中加入含有50 mM咪唑的平衡缓冲液400 μL洗涤柱。 保留第一次洗涤用于分析。
14. 4°C, 1000 × g，离心 1分钟。
15. 重复步骤 14和 15 三次，然后进行步骤 16。将最后的洗涤液保存在4°C以供分析。
16. 将 80 μL 洗脱缓冲液加载到柱上，在4°C 下孵育10分钟。
17. 4℃，1000 × g离心 1 min，保留洗脱后的馏分。
18. 用洗脱的馏分重复步骤16和 17。将洗脱的馏分保持在4°C进行分析。
3.3 使用纯化蛋白作为猎物的Pull down试验
1. 50 μg his 标记的诱饵蛋白与 50 μg纯化的猎物蛋白在 400 μL 平衡缓冲液的总体积中孵育2.5 h，在4°C搅拌下孵育。
2. 向重力流柱中加入 80 μL Ni-NTA 琼脂糖珠.
3.用加有20 mM咪唑的400 μL平衡缓冲液平衡柱子。
4. 4°C, 1000 × g离心 1 min。
5. 将 400 μL 孵育的诱饵和猎物蛋白上柱。在冰上静置孵育 10 分钟。
6. 4°C, 1000 × g离心1 min。在4°C 下保持流动以进行分析。
7. 柱中加入400 μL平衡缓冲液，外加20 mM咪唑洗涤。
8. 4°C, 1000 × g离心1 min。4°C保存第一次洗涤液用于分析。
9. 重复洗涤步骤 7和 8 四次，并将最后洗涤液保存在 4°C 以供分析。
10. 柱中加入200 μL洗脱缓冲液，冰上孵育10分钟。
11. 4°C, 1000 × g 离心1 min。洗脱后的馏分保存在4°C 进行分析。
3.4 SDS-PAGE及蛋白组分分析
1. 对 15 μL蛋白馏分加入5 μL裂解缓冲液，4倍浓缩。100℃加热3 min，用微离心机离心30 s，取下凝析液。
2. 在 SDS——聚丙烯酰胺凝胶上上样 10 μL 洗脱蛋白和5 μL 蛋白maker。
3.电泳蛋白在100 V 下运行缓冲液15分钟，然后180 V，直到染料前端到达凝胶底部。
4.通过免疫检测或蓝色考马斯色法鉴定相互作用蛋白[1]。
卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)多年致力于蛋白相互作用研究，卡梅德生物坚持为客户提供高品质的服务内容，能够提供从重组蛋白制备到pull down蛋白互作检测等一站式技术服务，满足不同客户的需求。
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参考文献：
- Louche A, Salcedo SP, Bigot S. Protein-Protein Interactions: Pull-Down Assays. Methods Mol Biol. 2017;1615:247-255.
- Costa TRD, Felisberto-Rodrigues C, Meir A, et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Microbiol. 2015;13:343–359
- McBride MJ, Nakane D. Flavobacterium gliding motility and the type IX secretion system. Curr Opin Microbiol.2015; 28:72–77