定量与标准化

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听张旭东老师的课

需要的R软件包

• Rsubread
• limma
• edgeR

featureCounts

• featureCounts只能算出counts, FPKM值或TPM值需要自己根据公式标准化算

张老师的R定量package

• run-featurecounts.R

  
  
  run-featurecounts.R
• R脚本解释器(第一行)最好写 #!/usr/bin/env Rscript —— 功能，自动识别环境中的解释器
• argparser软件包实现对代码的封装，自动解析要输入的参数及参数传递，并生成-help 界面(python中也有)
• 运行命令
  Rscript script/run-featurecounts.R -b xxx.bam -g xxx.gtf -o xxx # 给个名字就好，不需要后缀，会自己加后缀；
  输出一个.count文件和一个.log文件

合并表达量矩阵

• 新建文件夹，名为3.merge_result, 内含合并脚本
• 合并readsCount矩阵
  输出gene.counts.matrix
  要用于差异分析(一般差异分析软件内部会进行标准化过程)
  可能有小数
• 合并标准化后的矩阵
  输出genes.TPM.matrix
• TPM+TMM标准化矩阵
  输出genes.TMM.EXPR.matrix文件
  TPM为样本内标准化
  TMM为样本间标准化
  所以标准化流程为 readsCount → TPM标准化 → TPM+TMM标准化
  用于差异分析外的分析：共表达分析、PCA分析、画Heatmap
• 用小程序搞定
  • perl脚本 abundance_estimates_to_matrix.pl
  • 用法：
    perl abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method featureCounts xxx1.count xxx2.count ...... xxxn,count
    或 perl abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method featureCounts *.count
    或 将要读取的文件路径放在同一文件genes.quant_files.txt文件下，perl abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method featureCounts --quant_files genes.quant_files.txt --out_prefix genes

run_TMM_scale_matrix.pl

接下来

• 达到表达矩阵之后首先做的不是差异分析，应该先做样本关系分析，如样本聚类分析、样本相关性分析、PCA分析

题外话

• 基因组与比较基因组注释
  Braker
  Maker
  PASA
• bash 换行 “\”后面不能有空格
• RSEM软件功能类似于featureCounts，有参无参都能用，通常用在无参转录组