2021-05-31 策反——CRISPR/Cas9新玩法

  以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑应用已是层出不穷了。大部分的CRISPR/Cas9系统需要核酸酶Cas9和crRNA/tracrRNA协同参与，crRNA中携带有与靶向DNA互补配对的序列和与tracrRNA配对的序列，如此形成功能性guide RNA。而同样是RNA，tracrRNA是否就一定只能与crRNA互作呢？今天分享的这项研究就告诉我们答案了——tracrRNA可以与细胞内其他RNA配对形成duplex，在RNase III等酶的加工下，产生具有活性的非经典guide RNA，进而靶向DNA；也就是说，tracrRNA可以“策反”细胞内的RNA，为己所用。此外研究者还根据这一发现，通过定制特定的tracrRNA，实现不同种CRISPR/Cas9利用内源RNA进行基因编辑与基因检测的目的。

tracrRNA“策反”内源RNA

三言两语
1.利用C. jejuni strain CG8421中CjeCas9的RIP-seq，研究者发现tracrRNA可以与体内一些RNA配对，在核酸酶的作用下将这些内源RNA加工成noncanonical crRNA（ncrRNA），CjeCas9与ncrRNA/tracrRNA形成的复合物可以靶向DNA。不过C. jejuni中CjeCas9与ncrRNA/tracrRNA并不能靶向产生ncrRNA的基因组DNA，这主要是因为没有合适的PAM序列，这似乎也是这一现象之所以存在的原因。如果一个位点即存在产生rncRNA的可能性，又有合适的PAM，势必造成该位点DNA的突变，最终结果也是造成CjeCas9与ncrRNA/tracrRNA不能靶向ncrRNA的基因组DNA。

2.既然存在ncrRNA的现象，是否可以通过改造tracrRNA，实现其“策反”目标RNA的目标呢？研究者通过测试一系列tracrRNA与ncrRNA配对区的突变体，发现ncrRNA/tracrRNA配对区的二级结构，而不是序列对于其活性起到关键作用。因此，可以通过定制tracrRNA中与ncrRNA配对的区域，实现内源RNA的“策反”。基于此，研究则针对CjeCas9，SpyCas9和Sth1Cas9三个系统中的tracrRNA进行改造，发现都可以实现内源RNA的“策反”。

3.基于改造的tracrRNA，研究则开发了LEOPARD，可以用于RNA检测。其原理是：将待检测样本的RNA与Cas9和改造的tracrRNA，以及靶标DNA混合孵育后，如果待检测样本中含有可以被tracrRNA“策反”并靶向靶标DNA的RNA区域，则Cas9可以切割靶标DNA，通过分析靶标DNA的大小变化即可判定。

LEOPARD

PS. 不知道这种改造tracrRNA“策反”内源RNA的策略是否也可以应用到哺乳动物细胞。

Reference
Jiao, C. et al. Noncanonical crRNAs derived from host transcripts enable multiplexable RNA detection by Cas9. Science 372, 941-948 (2021).