文献分享-神经内分泌肿瘤血浆cfDNA 的纵向拷贝数改变分析是用于诊断、预后和随访的新型特异性生物标志物

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由于cfDNA的非侵入性特性，所以cfDNA数据本身就是一个亮点。今天分享22年1月份发在CCR的一篇文章 Longitudinal Copy-Number Alteration Analysis in Plasma Cell-Free DNA of Neuroendocrine Neoplasms is a Novel Specific Biomarker for Diagnosis, Prognosis, and Follow-up

小科普

开始前进行一个小科普：

• cfDNA：cfDNA全名为cell-free DNA，主要存在于血浆，为游离的DNA 片段
• ctDNA：ctDNA全名为circulating tumor DNA ，从肿瘤细胞释放的cfDNA称为ctDNA

课题设计

从分化良好的转移性胃肠胰和肺 NEN 患者收集纵向血浆样本。cfDNA 进行浅层全基因组测序，以检测全基因组拷贝数改变 (CNA) 并估计ctDNA分数，并与临床病理学和生存数据相关联。为了使用液体活检区分胰腺 NEN (PNEN) 和胰腺腺癌 (PAAD)，使用基于组织的 CNA 训练分类模型并在 cfDNA 中进行验证。

流程

数据：

• 作者数据1：由八家比利时医院组成的网络中，高分化且转移性 GEP- NEN 和肺 NEN的患者在依维莫司治疗开始时被前瞻性纳入，并密切跟踪每 2-3 个月的成像和两个月血浆采集，直至疾病进展、依维莫司治疗终止或在 24 个月后达到研究结束。在安特卫普大学医院 (UZA) 前瞻性地收集了 NEN 患者的血浆样本，每 6 个月进行一次采样。
• 作者数据2：来自 100 名健康受试者的血浆样本，即来自常规无创产前检测 (NIPT) 的女性，被用作参考样本。
• 公共数据1：EGAD00001002684：98 个 PNEN 和 98 个配对正常组织样本的WGS 数据
• 公共数据2：EGAD00001003927：109 个 PAAD和 40个正常组织样本的WGS 数据
• 公共数据3：PRJNA633741：96 个 PAAD患者cfDNA 样本的浅层 WGS (sWGS) 数据

OS 计算为自纳入研究（即第一次采样）到死亡或审查的时间。PFS计算为从依维莫司治疗开始直到研究者评估进展或审查。“目标病灶最长直径总和”（DSUM）是根据 RECIST 1.1 确定的。

结果

1.患者特征

总共从 43 名患者（40个 GEP-NEN 患者，3个肺 NEN 患者）中前瞻性收集了 195 份纵向血浆样本。

table1 研究队列的患者临床病理学特征与 ctDNA 阳性之间的关联

2.检测血浆样本中的 ctDNA

一个样品不符合质量标准，并被移除以进行进一步分析。该分析在 194 个 cfDNA 样本中的 58 个（30%）中检测到 ctDNA。在 43 名患者中的 19 名 (44%) 中，至少有一份样本为 ctDNA 阳性 (ctDNA + )。来自健康个体的样本均为 ctDNA 阴性 (ctDNA - )，验证了队列的预定肿瘤分数截断值。

• ctDNA 阳性与较高的 WHO 分级、原发肿瘤的存在和原发肿瘤的位置显着相关。
• 相对较高比例的 PNEN (62%) 以及胃和原发性肿瘤未知 (PTU) NEN 均为 ctDNA +，而只有 24% 的小肠 NEN (siNEN) 为 ctDNA +，所有 3 个肺 NEN 均为 ctDNA -。
• 纳入时的治疗与 ctDNA 阳性显着相关，接受后期治疗（如依维莫司）的患者更频繁地出现 ctDNA +。

3.cfDNA 浓度和肿瘤标志物值与 ctDNA 阳性的关联

在ctDNA +样本中测量到更高的 cfDNA 浓度和更高CgA 值、NSE值（补充图 S1）。总共有 51% 的样本与 CgA 和 ctDNA 一致，例如，均为阳性或均为阴性，46% 为 CgA + /ctDNA -，而 3% 为 CgA -/ctDNA + . CgA - /ctDNA +样本来自 2 名患者，因此与单独的 CgA 分析相比，ctDNA 分析可以提高诊断率。总共有 55% 的样本与 NSE 和 ctDNA 一致，40% 为 NSE + /ctDNA -，5% 为 NSE - /ctDNA +。一名患者的唯一样本和另一名患者的两个样本是 NSE− /ctDNA +，因此 ctDNA 分析可能会为这些患者/时间点提供额外的信息。

图S1

4.ctDNA 检测的预后特性

ctDNA 阳性的单变量 CoxPH 模型显示，ctDNA +患者的死亡风险显着更高。由于原发肿瘤的位置与ctDNA阳性显著相关，并且已知其可决定NEN患者的预后，研究者们根据肿瘤病灶位置进行了子集分析。在 PNEN 亚组中，ctDNA 阳性与 OS 之间的关联仍然显着。在 siNEN 子集中无法观察到关联。

图1

5.在 PNEN 中检测到的 CNA 模式对应于在肿瘤组织中检测到的模式

测定了公共数据集98 名 PNEN 患者肿瘤组织中的 CNA 谱，显示所有样本中均可检测到 CNA。为作者自测的 ctDNA +PNEN 患者和 PNEN 组织数据集的 cfDNA 中检测到的 CNA 生成频率图。通过对频率图的目视检查，cfDNA 和肿瘤组织中的 CNA 模式非常相似，此外，它们也显着相关（Spearman 相关系数 = 0.82，P < 2.2e-16）。该结果验证了 cfDNA 中检测到的 CNA 模式的 PNEN 肿瘤起源。

图2

6.可以使用 CNA 配置文件将 PNEN 与 PAAD 区分开来

由于检测到的 CNA 在 PNEN 中具有特定的模式，作者假设检测到的 CNA 模式可以将 PNEN 与更常见的 PAAD 区分开来。首先在 PNEN 和 PAAD 的组织数据集上生成和验证分类模型，然后在 PNEN 和 PAAD cfDNA 数据集上进行测试。为PAAD 组织数据集和 c cfDNA 中检测到的 CNA 生成频率图（图S2）。
最终的二元逻辑回归分类模型由五个 PC 组成，对组织训练集和验证队列中性能良好。然后使用该模型预测所有 ctDNA ⁺ PNEN ( N = 45) 和 PAAD ( N = 84) cfDNA 样本的肿瘤类型。在 cfDNA 队列中，具有良好的特异性。

图S2

7.在依维莫司治疗的患者亚组中，纵向肿瘤比例与疾病进展相关

在对患者体内 ctDNA +样本的 CNA 模式进行目视检查后，随着时间的推移几乎没有观察到变化。在患者 P01 中，第一个和最后一个样本之间唯一观察到的差异是 15 号染色体中的亚克隆增益。在 P04 中，在其中一个时间点观察到几个额外的亚克隆增益；然而，此时肿瘤比例非常高，这导致对亚克隆改变的敏感性更高，因此不一定反映新发生的改变。在 P05 中，两个样本之间观察到更明显的变化，这两个样本相隔 3 周，这可以通过在该患者中观察到的治疗下的去分化和进展来解释。在 P06 中，包含 4 个月后出现了 6 号染色体长臂的亚克隆缺失。

图3

为了评估肿瘤比例的纵向测量值和 PFS 之间可能存在的关联，作者建立了一个联合模型。肿瘤比例的增加导致 PFS 概率降低。

图4

2 名代表性患者的肿瘤比例随时间的演变。在 P06 中，在达到自纳入以来的最低肿瘤比例后，肿瘤比例增加了 4 个月，之后在成像上也观察到进行性疾病。在 P17 中，治疗开始后肿瘤比例下降到无法检测到的水平，并且在该患者的成像中观察到持久稳定的疾病。在P04的长期随访期间由于选择性冠状动脉旁路移植手术，在治疗中断期间观察到第一个 ctDNA+样本，但随后肿瘤比例降至无法检测的水平。后来，肿瘤比例开始急剧增加，这与肿瘤大小（DSUM）的增加重叠，最后也是研究者评估的疾病进展。改用 CAPTEM 治疗导致肿瘤比例急剧下降，随后肿瘤大小减小。因此，肿瘤比例的减少可能是对治疗反应的早期指标。

图5

Summary

1. 是第一项纵向研究神经内分泌肿瘤中cfDNA
2. 有作者前瞻性收集的队列，如上数据部分
3. 总之，作者在具有多种临床应用的肺和 GEP-NEN 队列中证明了纵向血浆 cfDNA CNA 分析的生物标志物潜力。说明在 cfDNA 中检测到的 CNA 是肿瘤衍生的，并且 cfDNA 中的 CNA 模式可以帮助诊断分类 PNEN 和更常见的 PAAD。此外，可检测到 ctDNA 的患者 OS 较差，纵向肿瘤比例测量与 PFS 相关，可能有助于预测肿瘤进展。因此，该研究是临床实施 NEN 的 ctDNA 分析的重要第一步，并显示出在诊断、预后和随访方面的前景，以及作为活检的替代方法，用于检测肿瘤相关的分子改变。

参考文献

Gitta Boons, Timon Vandamme, Laura Mariën, Willem Lybaert, Geert Roeyen, Tim Rondou, Konstantinos Papadimitriou, Katrien Janssens, Bart Op de Beeck, Marc Simoens, Wim Demey, Isabel Dero, Guy Van Camp, Marc Peeters, Ken Op de Beeck; Longitudinal Copy-Number Alteration Analysis in Plasma Cell-Free DNA of Neuroendocrine Neoplasms is a Novel Specific Biomarker for Diagnosis, Prognosis, and Follow-up. Clin Cancer Res 15 January 2022; 28 (2): 338–349. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-21-2291