2018 NatBioTech Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR–C...

摘要

用荧光蛋白进行基因标记对于研究细胞蛋白的动态特性至关重要。 CRISPR–Cas9技术可将荧光标记插入任何目标基因（gene of interest, GoI）实现融合蛋白的功能和生理表达。至关重要的是，仔细评估此类基因组编辑的细胞系，以防止由以下因素引起的脱靶效应：（i）荧光蛋白的不正确插入；（ii）荧光蛋白对融合蛋白的干扰；或（iii）非特异性基因组CRISPR–Cas9对DNA的损害。在该协议中，我们提供了系统性的流程和逐步描述，便于大家生成和验证纯合的荧光敲入细胞系。我们使用配对的Cas9(D10a)切口酶，通过同源性定向修复（HDR）将标签插入特定的基因组位点，且脱靶效应降至最低。对每个细胞克隆进行全基因组测序以检查哺乳动物细胞系中发生的自发遗传变异既费时又昂贵。因此，我们已经开发了一条有效的验证流程，包括连接PCR，Southern印迹分析，sanger测序，显微镜，Western分析和活细胞成像，以了解细胞周期动力学。该协议需要6到9周。通过该方案，可以用荧光蛋白纯合地标记多达70％的靶基因，从而导致融合蛋白的生理水平和表型功能性表达。

介绍

为了研究细胞内蛋白质的动力学和功能，研究人员通常使用荧光标记物标记蛋白质。 Mahen等人1揭示，在内源基因组位点标记蛋白是通过活细胞成像和生物物理方法研究融合蛋白定量特性的最佳选择。为了反映蛋白质在单个细胞内的生理浓度并确保标记的蛋白质完全取代内源蛋白质的功能，必须使用荧光标记所有等位基因。该协议描述了如何生成表达纯合标记蛋白质的细胞系，以分析活细胞中的蛋白质组动力学，并使用荧光相关光谱法校准的4D活细胞成像系统地在四个维度上系统地定量绘制细胞蛋白质组图。我们以前曾将此协议与本期随附论文中描述的协议一起使用2来生成细胞，以研究核孔装配并分析活细胞中蛋白质组动力学2-4。

流程的发展

我们的基因组编辑方法基于Ran等人5和Trevino等人6描述的方法，这些方法使用Cas9切口酶在真核系统中进行基因组编辑。在哺乳动物细胞中用于基因组编辑的所有核酸酶（例如，锌指核酸酶（ZFN），转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR–Cas9）都会在特定的基因组位点触发双链DNA（dsDNA）断裂。主要通过两个DNA修复途径修复：非同源末端连接（NHEJ）和HDR7。对于产生敲入细胞系，HDR对于插入目标标签至关重要。这是在dsDNA break5,8-16期间存在外源引入的修复模板才可完成的。 CRISPR–Cas9系统由野生型（wt）Cas9或突变型Cas9组成，分别在小向导RNA（gRNA）的引导下引入dsDNA断裂或单链DNA切口。我们已使用配对的Cas9 D10A切口酶方法，以特定的验证流程以中等通量方式生成了纯合标记的目的基因，如本协议中所述。配对的Cas9D10A切口酶方法将Cas9切口酶突变体（D10A）与靶向目标区域的有义和反义DNA链的成对gRNA结合在一起，以引入靶向的双链断裂5、6、10、17，在存在含有荧光标记的DNA模板时会产生HDR。这种方法是生成内源标记细胞系的最合适方法，因为它避免了脱靶效应，同时为生成内源标记细胞系提供了有效的DNA修复6,16-20（图1）。我们已经使用配对的Cas9D10A切口酶方法常规生成了纯合的敲入细胞系，与纯ZFN时的46％相比，纯合子的敲入细胞系产生了70％（数据未显示）。这些数据证实，成对的Cas9D10A切口酶方法更易受HDR影响，正如Bothmer等人18和Miyaoka等人19所表明的那样，这很可能导致纯合效率提高（请参阅“与其他方法的比较”部分”以获取更多详细信息）。

有几例报道抑制NHEJ修复途径来增加HDR和随后的纯合性[21-26]。 但是，通过RNA干扰DNA连接酶4（LIG4）或X射线修复交叉互补蛋白4（XRCC4）耗尽后我们没有观察到纯合性的实质性改善（数据未显示）。 同样，我们发现添加NHRJ修复途径抑制剂Scr7不会增加纯合子的可能性，这证实了Greco等人的数据26（数据未显示）。 破坏DNA的试剂可损害有丝分裂27，并且因为我们主要研究有丝分裂蛋白，所以我们不想破坏DNA修复途径的机制，以防影响细胞周期。

几项研究已经研究了NHEJ和HDR在人类细胞的细胞周期中对DNA的修复作用28-30。在细胞周期中，G1期几乎不存在同源重组，但S期最活跃。因此，我们在细胞转染前24-48 h剥夺血清，使细胞部分同步于G1期。然后，在靶向dsDNA断裂期间，我们将细胞释放到S期，以增加存在修复模板时HDR的机会。对于某些基因靶标，这种方法导致纯合子的轻微增加，最高可达2％，但不是全部（数据未显示）。尽管这只是纯合性的少量增加，但是我们尽可能进行血清剥夺，因为对于某些目标蛋白（POI），只有少数克隆被纯合标记。

当荧光蛋白（FP）标签的结构和大小扰乱融合蛋白的功能时，纯合标签对于某些必需蛋白是不可行的。因此，某些基因只能被杂合标记。根据我们的经验，根据系统性cDNA标记工作的数据，约25％的人类基因无法用FPs功能标记。

仔细验证基因组编辑的细胞系对于控制脱靶效应至关重要，这可能是由于在基因组中其他位置插入FP标签，FP对融合蛋白的干扰或gRNA的非特异性结合造成的非特异性DNA损伤而引起的，导致dsDNA断裂和基因组重排。 Landry等人[32]证明，HeLa Kyoto细胞等细胞系的基因组不稳定，可能导致自发突变。此外，每个细胞克隆的全基因组测序（每个候选对象最多50个细胞克隆）既昂贵又费时。当使用非癌细胞系时，考虑仅使用少数经过验证的细胞克隆进行全基因组测序是合理的。许多标记细胞系的生成通常是研究细胞内的途径或蛋白质复合物和网络所必需的。因此，我们建立了用于基因组编辑细胞系的验证管道，其中在工作流程的每个级别上都进行了有效的质量控制（图2），以确保保留每个POI的高质量纯合和杂合细胞克隆并用于进一步的实验。如果仅产生了杂合标记的克隆，则对这些克隆进行第二轮基因组编辑以实现纯合。另外，由于dsDNA断裂而没有重组(产生mutation)，杂合标记的克隆在未标记的等位基因中可能丧失功能，这可能导致伪纯合细胞克隆仅表达重组的等位基因中的标记融合蛋白。工作流程中每个步骤的详细信息将在“实验设计”部分中进行讨论。

应用领域

可以使用此协议标记任何POI。 我们小组的主要兴趣是参与细胞分裂和细胞周期控制的蛋白质的。 因此，该协议包含一个细胞周期分析步骤。 如果标记了其他信号通路的蛋白质，则可能需要进行其他分析，或者可以自行修改“细胞周期分析”部分。

只要需要保持标记蛋白的生理表达水平及其功能性的标记蛋白，内源标记细胞均可用于任何应用。

限制

按本方法操作70％的靶向基因被FPs纯合标记，且融合蛋白按生理水平和表型功能表达。 但某些蛋白质不能被纯合标签，因为FP标签的结构和大小会扰乱融合蛋白的功能。 因此某些基因只能杂合标记。 此外，还应考虑要表达的POI分子的丰度，因为在表达少量标记蛋白时某些方法存在检测极限(目标蛋白太少检测不到)。

与其它方法比较

CRISPR–Cas9技术发展迅速。主要问题之一是脱靶效应，通过使用配对的Cas9D10A切口酶可以大大降低脱靶效应。此外，据报道转染预先形成的Cas9 gRNA复合物（Cas9核糖核蛋白（Cas9RNP））可提高基因敲除的效率，并且脱靶效应33-35。然而，根据我们的经验，使用Cas9RNP或mRNA而不是质粒表达Cas9蛋白并不能提高人细胞系中纯合敲入的效率（数据未显示），反而很大程度上导致了杂合标记的基因。 Roberts等人36还报告了在人类干细胞中使用CRISPR–Cas9RNP进行系统性基因标记的方法中仅杂合标记的基因。但是，此协议的应用是执行定量FCS校准的活细胞成像（请参阅本期随附的协议4）。这依赖于纯合的荧光标记蛋白。因此，具有当前性能的Cas9RNP方法目前不适合该管道。

Paix等[37]证明具有短同源臂的线性DNA可用作DNA修复模板，可用于基因组编辑敲入方法。我们能够使用由mEGFP组成的双链线性DNA模板，其侧翼为短50 bp的同源臂，但只能产生杂合的敲入细胞系，而不会产生纯合的敲入（数据未显示）。

Paquet等[38]表明，通过Cas9RNP使用单链寡核苷酸供体（ssODN）进行纯合突变导入，需要靶向接近预期突变的gRNA。在我们的实验方案中，gRNA的位置也靠近或应该插入标签的目标位置，因此在荧光标记或其他标签（例如Halo或SNAP）的纯合导入中具有良好的效率。感兴趣的地点。但是，我们必须通过质粒供体引入一个约700-750 bp的荧光标签，因此，我们不能像Paquet等[38]所描述的那样使用ssODN。如上所述，根据我们的经验，尽管杂合标签是可能的，但结合质粒DNA作为供体的Cas9RNP方法并不成功。

总而言之，目前此方案中所述的基于配对Cas9D10切口酶质粒的方法仍然是敲入人细胞系生成具有纯合荧光基因的最佳程序。

实验设计

gRNA和供体质粒的设计

gRNA和供体的设计取决于POI的标记位置，通常在N或C末端。 谨慎地进行扩展文献搜索以查找定位数据，对POI标记版本进行功能研究以及其他物种（如酵母或小鼠）中的表达数据，以洞悉可以标记POI的哪个末端，同时保持其功能和定位的正确。

种子区域内的点突变，即原间隔邻近基序（PAM）10-12个碱基以内的序列，可降低gRNA结合活性39。 因此，所用细胞系的序列变异（例如单核苷酸多态性（SNP））与参考基因组不同，GOI的同工型可能会干扰CRISPR–Cas9靶向。 因此，建议不仅在用于标记的GOI区域内而且还要对可能的同工型进行测序。

gRNA应直接结合靶位点，例如开放阅读框的起始或终止密码子。 HDR最好在dsDNA断裂位点100 bp内。此范围外，HDR的效率下降了四倍9。使用Cas9D10A切口酶时，需要两个gRNA，一个用于反义，一个用于有义DNA链。将适当设计的gRNA6、9、17、18作为退火的寡核苷酸插入包含两个表达盒，人密码子优化的Cas9D10切口酶和gRNA的Cas9 / gRNA表达质粒中。

供体质粒含有进行同源重组的模板和荧光标记基因（例如，mEGFP或mCherry），所述荧光标记基因的侧翼与GOI的靶位点具有500至800bp的同源臂。

荧光标记替换起始密码子或终止密码子，并与GOI一致。默认情况下，标签和基因之间应该有一个短的柔性接头，以改善标签蛋白的功能。供体质粒不应含有外源启动子或哺乳动物选择标记，避免靶基因未发生重组而具有选择标记。质粒的递送方法取决于所选的细胞系而进行优化。 HeLa Kyoto细胞可通过脂质转染进行很好的转染，脂质转染可用于在此方案中生成内源标记的细胞系。

荧光蛋白阳性细胞克隆的荧光激活细胞分选

供体质粒用作DNA修复模板。 BacORI是在大肠杆菌中复制质粒必不可少的，但含有隐蔽的启动子区域。细胞中只要有该质粒，就可以在基因组整合之前产生某些背景表达40。因此，在转染后7-10 d进行单细胞分选以选择荧光细胞，从而减少了荧光激活细胞分选（FACS）期间假阳性细胞克隆的数量。根据选择的FACS后细胞系中单细胞的存活率，应分类数百个单细胞克隆以进行下游鉴定。通常，必须针对每种亲本细胞系优化单细胞克隆的最佳生长条件。该协议中的条件已针对广泛使用的HeLa Kyoto细胞进行了优化。 HeLa Kyoto wt细胞用作阴性对照，以区分非特异性和特异性FP / mEGFP表达水平。

用DAKO MoFlo高速分选仪对细胞进行分选，并通过EMBL的流式细胞术核心设施（Heidelberg；图3）进行分选。设置和校准如下：BD FACSFlow被用作鞘液。该仪器装有一个100 µm的喷嘴头，液滴的产生频率约为40 kHz。初级激光是调谐到单线488 nm 200 mW输出功率（通过50/50分束器后撞击细胞的100 mW单相干Saber氩离子激光器）。该激光器用于产生前向和侧向散射（分别为FSC和SSC），以及用于激发GFP。次级激光器是相干马刀K离子激光器。在mCherry的激发中将其调谐至568 nm（200 mW）的单线，在Cerulean的激发中将其调谐至多线紫（MLVio：406.7–415.4 nm）。激光束已仔细对准MoFlo的主要光路。在运行Flow-Check荧光球期间，可以优化光路的对准。样品事件是在液滴占比小于25％的情况下获得的。样品-护套的压差低，无法将细胞限制在同轴流的中心，因此限制了光照变化。排序决策门基于在多个2D图中围绕目标人群绘制的区域的组合：FSC面积与SSC面积； FSC面积与FSC脉冲宽度和荧光的关系。在将分类目标细胞克隆到含有生长培养基的96孔板的过程中，使用了一个一滴模式。使用Moflo Summit软件和FlowJo（Tree Star）软件分析数据。

内源性标记蛋白的荧光信号取决于它们的生理表达水平，与常用的过表达系统相比通常相对暗淡，必须使用高灵敏度的FACS分选仪。 对于细胞周期调节的蛋白，可能还需要在特定的细胞周期阶段同步细胞，以使细胞富集FACS信号。 质粒转染后7-10 d阳性标记细胞的效率介于0.05％和10％之间（例如，图3），但通常约为0.5％。 HeLa Kyoto wt细胞用作阴性对照并定义背景信号（图3，上图； HeLa细胞，0.04％GFP阳性），并相应设置阳性GFP细胞的门。 对于mEGFP-NUP358，获得了1.76％的mEGFP-NUP358阳性细胞（图3，下图； mEGFP-NUP358），并分入96孔板中。

连接PCR

可以使用结合在基因组基因座中同源臂外部和重组荧光标签内的引物，通过PCR检测荧光标记物是否正确整合到预期的基因座中（图4a）。 为了确定所有等位基因是否都被荧光标记标记（纯合性），使用位于左右同源臂外侧的引物。 所得的一种或两种PCR产物分别表示纯合或杂合。 但由于两种PCR产物之间的竞争，可能无法检测到杂合克隆中的标记基因（图4b）。 因此，建议在同源臂内用引物重复连接PCR，这会导致PCR产物缩短（图4c）并改善两种PCR产物的扩增。 但是，当使用目标位点的GOI引物时，纯合标记的基因将始终仅产生一种PCR产物（图4，克隆号97）。

sanger测序

用靶区域周围的引物进行PCR，然后进行Sanger测序41,42，以检测基因组位点标签插入位点内的突变。亲代wt细胞和供体质粒的序列用作参考。图5显示了一个测序实例，随后进行比对分析。两个不同的表达mEGFP–NUP358的HeLa Kyoto细胞克隆纯合（图5，tagged 97）或杂合（图5，tagged 118和untagged 118）与mEGFP–NUP358供体质粒和HeLa Kyoto wt序列比对。 HeLa Kyoto wt和未加标签的118个不包含预期的mEGFP，但是在编号内有一个缺失（63 nt）。未标记的NUP358的第一个外显子缺失6个氨基酸（图5，untagged 118号）。但是，同一克隆的mEGFP–NUP358（图5，tagged 118）是正确的，并且mEGFP的整合在插入位点（图5，tagged 118）没有任何突变，正如预期的那样。纯合子克隆97仅包含标记的mEGFP– NUP358，从而将mEGFP正确插入目标位点（图5，tagged 97的位置）。因此，mEGFP已正确插入NUP358的N末端，该纯合标签的克隆可用于进一步的实验。

另外，如果在第一轮基因组编辑之后仅存在杂合细胞克隆，则对杂合细胞克隆的所有未标记等位基因进行测序，以检测靶区域内可能的突变。这很重要，因为点突变可能会阻碍第二轮基因组编辑的gRNA结合。由于FP的结构和大小，某些蛋白质无法被纯合标签，这会干扰蛋白质的功能。

Southern印迹分析

Southern印迹分析对于显示纯合性和排除标签的脱靶整合非常重要。针对该标签的探针应仅在Southern印迹上产生一种预期的产物（图6，GFP探针，mEGFP– NUP358）。但是，在某些情况下，会检测到其他DNA片段，这表明供体质粒的随机整合或dsDNA断裂后由于基因组重排而引起的其他脱靶效应（图6，GFP探针，绿色星号）。也可以插入多个mEGFP标签如克隆1和18所示（图6，GFP和NUP358印迹，克隆1和18，绿色星号），导致标记的DNA片段发生移位。随机插入的标签的表达应通过蛋白质印迹分析进行彻底研究，因为多余的FP会干扰下游实验（如定量活细胞成像）的结果4。

与同源臂外的内源目的位点结合的探针可检测杂合性和纯合性（图6，NUP358探针，Nup358和mEGFP–NUP358）。纯合子克隆仅产生一种预期产物，其大小与针对该标签的探针相同（图6，克隆编号97），而杂合子克隆有两种产物，一种用于标记的基因，一种用于未标记的基因（图6 克隆号118）。感兴趣的内源基因座内可能发生重排，并通过额外的意外条带检测到（图6，NUP358探针，红色星号）。此外，某些样本（例如克隆26和27）可以显示出带有标签GOI较小尺寸的产品，这与预期的一样，这可能是由于该区域内的缺失所致。

综上所述，没有额外的意外DNA片段的克隆将用于进一步的实验。

蛋白质印迹分析

荧光标记的蛋白的表达通过蛋白质印迹分析进一步表征（图7）。 FP抗体（例如抗GFP）以预期的大小将标记的POI的特异性表达检测为特定条带（图7，上图，抗GFP，mEGFP–NUP358 = 385 kDa）。当将供体质粒插入常染色质区域时，其随机整合可引起游离FP的表达，可检测到27kDa蛋白带。在HeLa对照样品中可见一个弱的非特异性条带，大小与游离GFP相同，进而会干扰游离GFP的检测。该非特异性条带最有可能是由于抗体的非特异性，这可以通过使用不同的抗体来解决。测试了来自多家公司（例如Abcam，Santa Cruz Biotechnology，Rockland和MBLand Roche）的GFP抗体，发现由Roche产生的GFP抗体最敏感，最特异性。但是，HeLa Kyoto mEGFP–NUP358克隆26和122似乎表达少量的游离mEGFP，因为使用GFP抗体可检测到较HeLa Kyoto wt细胞高的27 kDa的条带（图7，上图，抗GFP）。

游离FP的表达可能会干扰蛋白质表征实验，例如定量活细胞成像。表达游离GFP的克隆不可用于进一步的实验。利用蛋白质印迹分析内源引入的标签也可用于检测其他游离FP /标签的表达。

如Mahen等人1所示，针对POI的特异性抗体（如果可用）对于区分纯合和杂合克隆非常有用。 但是，在mEGFP–NUP358的情况下，这是不可行的，因为蛋白大，无法通过常规蛋白质印迹分析检测到358 kDa的未标记NUP358和385 kDa的标记的mEGFP–NUP358之间的差异。

细胞周期分析

在基因组编辑过程后，细胞周期可能会受到标签或脱靶效应的影响。我们小组的主要兴趣是参与细胞分裂和细胞周期控制的蛋白质的表征。因此，我们建立了由自动延时显微镜和分析组成的自动化工作流程，以一次测量许多细胞的细胞周期动力学（图8）。可以使用带有适当标记物的高通量显微镜对其他感兴趣的细胞功能进行类似的测定。

首先，将细胞核用SiR-DNA染色以确定每个单个细胞的细胞周期状态。随后，每5分钟执行一次自动活细胞成像，持续24小时（图8a）。图像被自动分析追踪单个细胞，检测相间和有丝分裂细胞并测量有丝分裂时间（图8b，c）。例如，测量从前期开始到后期开始的有丝分裂时间（图8c）并进行统计评估（图8d）。将有丝分裂的持续时间与wt细胞的持续时间进行比较。丢弃具有明显延长的细胞克隆（图8d，mEGFP-CDC20，克隆140）和缩短的有丝分裂时间（图8d，mEGFP-Bub3，克隆74）。

分析每个标记基因的所有细胞克隆的有丝分裂时间。例如，HeLa Kyoto mEGFP–NUP358细胞的所有克隆在有丝分裂期间均表现为HeLa Kyoto wt细胞（图9），这证实了它们在诸如FCS校准的4D活细胞成像2,4等未来实验中的用途。

必需的对照

内源性标记POI的优势在于，标记的蛋白不仅保留其生理表达水平，而且还保留其功能。但是，可能的脱靶效应和使用的FP可能会影响这一点。因此，必须开发验证工作流程来分析POI的正确表达和功能。

在生成和验证工作流程中，需要考虑几个控件。对照完全按照样品准备。每个验证步骤中每个样品/对照的制备在“程序”部分中有详细说明；在这里，我们提供所需控件的摘要。

gRNA功能测试的阴性对照是未转染的细胞对照，阳性对照是已验证的gRNA对（步骤26）。阴性对照的PCR产物带应只有一个条带，而用T7E1消化的配对切口酶样品应具有预期的几个切割带。 T7E1分析的替代方法是TIDE。 TIDE包括目标区域的扩增，Sanger测序和通过专门开发的分解算法对序列痕迹进行分析，该算法可识别计划的编辑位点中的主要诱导突变并准确确定其在细胞群体中的频率43。

FACS期间内源标记蛋白的表达水平可能非常低。因此，必须使用HeLa Kyoto wt细胞作为阴性对照来区分非特异性和特异性FP / mEGFP表达水平（步骤42）。

来自亲本细胞系（例如HeLa Kyoto）和水的基因组DNA可用作阴性对照，以验证标签在正确位点的整合并通过连接PCR测试纯合性（步骤48A）。

从亲本细胞系（例如HeLa Kyoto细胞）制备的基因组DNA可用作Southern印迹分析（步骤48B）和Sanger测序（步骤48C）中的阴性对照，以区分标记的DNA和未标记的DNA。

在蛋白质印迹分析中，可将源自亲本细胞的蛋白质提取物用于比较未标记蛋白和标记蛋白的表达水平（步骤48D）。

可以通过在固定细胞的显微镜检查过程中使用针对POI的抗体来确认标记POI的正确定位（步骤49B）。

将内源标记细胞系的细胞周期与亲代细胞（例如，HeLa Kyoto细胞）的细胞周期时序进行了比较（专栏1）。

与内源标记的POI相比，亲本细胞系中POI的表达和功能至关重要。但是，如果POI未知，将很难评估这些方面，并且可能必须生成一些工具，例如抗体。

材料

试剂

gRNA克隆

T7E1

细胞培养

转化

FACS

连接PCR

Southern Blot

sanger测序

Western Blot

活细胞和细胞周期分析

实验过程

gRNA设计 - 1d

gRNA设计。设计一对gRNA，一个与反义链结合，另一个与有义链结合，以使其中一个与目标位点（例如ATG或终止密码子）结合或尽可能接近。同源重组将最有效地发生在靶位点的100 bp之内，并且在该区域之外效率显着降低。使用http://crispr.mit.edu/或https://benchling.com/crispr9,44,45设计两个不同的gRNA对。可容忍的脱靶应包含至少2个核苷酸不匹配且位于PAM序列的8-12 nt 5'种子区域内。

设计用于gRNA克隆的寡核苷酸。使用BbsI消化pX335载体，并在gRNA支架之前将一对退火的寡核苷酸克隆到pX335载体中。根据目标位点序列（20 bp）设计寡核苷酸，其中3 bp NGG PAM序列位于3'末端，但不包括PAM位点。如https://www.addgene.org/crispr/zhang/（表1）所述，我们向gRNA中添加了BbsI位点，以将寡核苷酸克隆到pX335载体中。

订购表1中所示的寡核苷酸。

供体的设计合成14–21 d

供体设计。设计供体质粒DNA上荧光标记基因（例如，编码mEGFP或mCherry）两侧包含GOI两侧500至800 bp同源臂。荧光标记替换起始密码子或终止密码子，并与GOI和内源启动子一致。如果同源臂的末端富含GC或包含任何重复区域，则应将其缩短；否则800 bp效果很好。标签和基因之间应有linker维持标签蛋白的功能（可以使用5x甘氨酸或5x甘氨酸/丝氨酸重复序列）46；但是，如果有一个已知的linker已用于POI，则最好使用该linker。如果需要，在同源臂和插入物之间包含额外的克隆位点可以交换标签或linker（补充图1）。如果必须标记两个POI，则应使用mEGFP标记表达最低的蛋白质，因为它比mCherry明亮且稳定。使用单体荧光标签，例如mEGFP，mCherry或mCer3。供体的设计通常取决于gRNA，因为它应该与内源基因不同。否则，gRNA也会切割供体，导致HDR效率降低。因此，最好在起始或终止密码子之间使用gRNA（取决于N端或C端标签），以使供体由于插入标签而不同于内源性基因组基因座。关键！供体质粒中不含哺乳动物细胞的选择标记。如果在哺乳动物细胞中使用抗生素选择，则供体质粒到细胞基因组中的随机整合将增加。此外，供体质粒内不应存在CMV，RSV或任何其他外源启动子；否则，标记蛋白质的表达水平将不是生理性的，并且会出现伪影。

供体的基因合成。使用Geneart（Thermo Scientific）或Genewiz（Sigma-Aldrich）合成供体。关键！供体的合成可能需要长达21天的时间，具体取决于同源臂中的G / C％和重复序列。在生产期间，进行gRNA克隆和T7E1分析

将gRNAs克隆到pX335-u6-chimeric-bb-cbh-hspcas9n（D10a）载体 4 d

将每个gRNA寡核苷酸的正向和反向链重悬至ddH2O中的终浓度为100 µM。

100 µM正向和反向储备液各4 µl混合均匀。

使用以下参数在热循环仪中对正向和反向寡核苷酸（表1）进行退火：95°C持续5分钟，然后以0.1°C / s（〜5°C / m）的斜率冷却至25°C

结合以下成分，用BbsI（BpiI）消化pX335-U6-chimeric-BB-CBh-hSpCa9n（D10A）载体：

孵育后，将40 µl的消化产物中加入8 µl的6x上样染料，在含SYBR Safe染料的TBE缓冲液中的1％（wt / vol）琼脂糖凝胶上样，并在100 V下运行约20分钟。

根据供应商手册，使用QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化8.4 kb的消化产物。 用30 µl EB缓冲液（试剂盒的一部分）洗脱DNA。

使用Roche快速连接试剂盒将退火的寡核苷酸连接到BbsI消化的pX335中。 准备每个gRNA的寡核苷酸和用于以下连接反应的无插入阴性对照：关键！在先前公布的方案9中，对退火的寡核苷酸进行了磷酸化处理，并对载体进行了去磷酸化处理，这可能导致假阳性菌落数量增加或完全没有菌落。 当前的方案可靠地产生了正确插入gRNA寡核苷酸的阳性菌落，尽管您可能会发现有时只产生几个菌落。

-17转化提质粒

测序确认sgRNA正确插入质粒

使用t7e1测试grnas功能 5 d

-22培养HeLa Kyoto细胞

在转染前1 d，在2 ml正常生长培养基中的六孔细胞培养皿上每孔接种1.5×105个细胞，并在37°C，5％CO2下孵育1 d。转染过程中细胞应至少融合50％。

第二天，将gRNA质粒在200 µl jetPrime缓冲液中稀释，浓度如下表所示。

-32转染后培养细胞提取基因组

Touchdown PCR。 设计引物最终产生的700至1,000 bp PCR产物。 通过CRISPR–Cas9成功切割此PCR产物应产生两个片段。 每个剪切片段应为〜300 bp，长度应相差100–200 bp，在2％（wt / vol）琼脂糖凝胶上产生两个可检测的条带。 使用HotStar HighFidelity PCR试剂盒扩增目标区域，并如下所述设置每个反应：

使用以下循环条件放大目标区域：

在2％（wt / vol）琼脂糖凝胶上跑2 µl PCR产物。 应该存在一个扩增片段。 将3 µl PCR产物放在冰上，以备以后在步骤36中进行分析。

使用剩余的15 µl PCR产物进行以下变性/再退火循环以生成异源双链DNA：

通过添加1.8 µl 10×NEB缓冲液2和1.2 µl T7核酸内切酶I消化15 µl异源双链DNA。在37°C下孵育30分钟。

在2％（wt / vol）琼脂糖凝胶上分析18 µl T7E1消化产物。 运行3 µl未消化的PCR产物以比较切割效率。 阴性对照的PCR产物带应只有一个条带，而用T7E1消化的成对的双切口酶样品应具有预期的几个切割带。 在步骤39中应使用具有最高切割效率的gRNA对，将荧光标记基因导入目标基因座。

使用质粒的配对CRISPR–Cas9方法 7–10 d

关键！CRISPR-Cas9配对方法已用于许多哺乳动物细胞系6、7、16-18。 必须优化每个细胞系的转染条件。 下述条件最适合HeLa Kyoto细胞。

用gRNA和供体质粒转染HeLa Kyoto细胞。在转染前，在2毫升Opti-MEM I培养基的六孔细胞培养皿中，每孔接种1.5×105个细胞，以使细胞饥饿。转染前1 d在37°C，5％CO2下孵育细胞。转染过程中细胞应至少融合50％。关键！当将细胞接种到无血清的培养基（如OptiMEM I）中时由于饥饿和G1阻滞，纯合子产率可提高2％。因此，细胞在转染后进入S期。在细胞周期的这一阶段同源重组更频繁。

（第2天）确保在转染过程中细胞至少融合60％。如下表所示，在200 µl jetPrime缓冲液中稀释从步骤37中选择的gRNA质粒和供体质粒。充分混合并加入4 µl jetPrime溶液，在室温下孵育15分钟，然后将转染复合物添加到细胞中。在37°C和5％CO 2下孵育4小时后，将转染培养基替换为正常生长培养基并培养细胞，直到它们汇合至〜80％

（第3-10天）当细胞达到约80％汇合时传代。 转染后7-10 d对1–2×107个细胞进行单细胞分选。

Facs选择表达荧光标签的单细胞克隆 10–19 d

关键！单细胞分选可能会导致某些细胞系的生长问题。 因此，重要的是建立最佳的生长条件，例如通过使用条件培养基。 条件生长培养基包含由亲代细胞系产生的生长因子。 条件培养基是一种体积的培养基的混合物，其中亲代细胞系在其中生长了几天，另一种体积是新鲜的完全生长培养基。 HeLa Kyoto细胞在单细胞分选中存活得比较好，存活率为30–50％。 用至少一个转染的10 cm细胞培养皿（如果可能，用1–2×15 cm细胞培养皿，每个含有1-2×107细胞）进行FACS，并将亲本细胞系用作阴性对照 。

（第1天）准备五个用于单细胞分选的96孔板，每个孔中添加100 µl生长培养基。

准备用于FACS单细胞分选的细胞。从HeLa Kyoto细胞的10厘米培养皿中除去生长培养基。每10厘米培养皿用5–10 ml PBS洗涤细胞。加入1-2 ml 0.05％的胰蛋白酶-EDTA，在室温下孵育直到细胞几乎从培养皿中分离（1-5分钟）。除去0.05％的胰蛋白酶-EDTA，并加入2 ml FACS缓冲液。彻底重悬细胞，并用细胞过滤器通过试管过滤细胞。使用HeLa Kyoto细胞作为FACS的阴性对照。

对表达荧光标记的细胞（通常为mEGFP或mCherry）进行单细胞分选，将其放入含有100 µl生长培养基的96孔板中，产生至少五个含有单细胞的96孔板。内源性标记蛋白的荧光信号通常相对较暗。阳性标记细胞的效率在阳性细胞的0.05-10％范围内，通常为0.5％。

（第2至12天）让细胞克隆在完全生长的培养基中于37°C，5％CO2下生长2至12 d。约5天后检查细胞生长在哪些孔中，单细胞克隆作为单个菌落生长。丢弃含有多细胞克隆的孔，这些克隆会在孔的不同区域以多个菌落的形式生长。培养单细胞克隆，使约50％的孔被细胞覆盖。

（第10–12天）要挑选克隆，请去除培养基并用1x PBS冲洗细胞一次。向每个孔中添加20μl胰蛋白酶，在室温下孵育1分钟，除去胰蛋白酶，添加100μl完全生长培养基，并将所有细胞转移至96孔板的新鲜孔中。

（第13天和第14天），如步骤45所述，通过胰蛋白酶消化将96孔板分开，并准备DNA复制品。

让克隆在96孔板上的37°C，5％CO2的完全生长培养基中生长，直到准备评估克隆是否表达正确标记的POI为止。通过胰酶消化（约80％融合）分裂细胞

敲入细胞系的验证。 按照选项A进行连接PCR，以验证荧光标记已整合到正确的位点并进行纯合性测试。 按照选项B进行Southern印迹分析，再次显示纯合性并排除标签的脱靶整合。 按照选项C进行Sanger测序，以检测基因组位点标签插入位点内的突变。 按照选项D进行蛋白质印迹分析，以研究随机插入标签的表达。

（a）验证荧光标记在正确的位置整合，并通过连接pcr测试纯合性 1 d（i）设计用于连接PCR的寡核苷酸。正向引物在左同源臂外侧5'端，反向引物结合荧光标记基因（表1）。检测所有等位基因是否在正确的基因座处标记（即它们被纯合标记），左同源臂外侧5'的正向引物和位于右同源臂外侧3'的反向引物。使用该引物组的两种PCR产物将指示杂合克隆（补充图2）。

（ii）关键步骤连接PCR不是定量PCR；因此，有时无法检测到杂合克隆中的标记基因，因为两种PCR产物之间存在竞争（图4）。如果在检测标记的基因时出现问题，建议使用用于T7E1分析的引物重复连接PCR，这将导致PCR产物更短，从而改善两种PCR产物的扩增。但是，使用T7E1引物进行实验的缺点是引物将位于同源臂内，这也会扩增随机整合的供体质粒。纯合标记的基因将总是产生一种PCR产物。由亲代细胞系（例如HeLa Kyoto细胞）制备的基因组DNA用于检测未标记的基因。水控制用于检测PCR期间可能发生的污染。

（iii）-（v）连接PCR的DNA制备。直接从96孔板中除去培养基，加入30 µl DNA裂解缓冲液。 重悬细胞并将DNA溶液转移到PCR管中。

（vi）将DNA溶液在56°C孵育1小时，然后在95°C孵育10分钟。 暂停poInt将DNA储存在4–8°C，直至进一步使用。

（vii）连接PCR。使用HotStar HighFidelity PCR试剂盒扩增目标区域，每个反应的设置如下：

使用以下循环条件放大目标区域：

（viii）-（xii）跑核酸电泳胶检测