从qPCR溶解曲线判断PCR产物的相对大小

在做qPCR的时候，40个循环之后，都会插入一步（6）：绘制溶解曲线。

Fig1.PNG

结束以后会出现下面的结果

Fig2.PNG

RFU为荧光单位，随着温度的升高，荧光值一直在下降，表明DNA双链在变性成为单链，但是下降速率却是不一样的，如绿色的线大概在85°后下降变快，蓝色和红色的线却在85°前下降变快，求它的导数(-d(RFU)/dT)即为对应的下降速率，如下图：

Fig3.PNG

那么，溶解峰会给我们提供什么信息呢？

上图的三种颜色代表了我三种不同的PCR产物片段（3个基因）
从左至右依次（产物名称，产物大小，GC含量，GC碱基对）：
A(蓝色)，141bp，59%，84
B(红色)，138bp，61%，85
C(绿色)，169bp，58%，99
结果会发现，溶解温度与产物的含有的GC碱基对数是正相关的（应该不是线性相关）
如果三个产物的GC含量一样，那么就可以大致判断，A 溶解峰单一表明PCR产物特异性好，
最大峰处对应的温度为PCR产物（不是引物）的Tm值，此时产物DNA片段一半为双链，一半为单链。
此外，PCR形成的引物二聚体溶解峰会在低于80°出现（分子量小）。