关于Fastq格式的一些想法

最近想写一个关于多软件批处理序列的脚本，在观察文件的过程中，发现了.fq格式和.fastq格式心中不免有些疑问——这两种格式有什么区别，查询资料后，在此阐述一下对fastq文件格式的看法。

FASTQ是基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式。其序列以及质量信息都是使用一个ASCII字符标示，最初由Sanger开发，目的是将FASTA序列与质量数据放到一起，目前已经成为高通量测序结果的事实标准。

格式说明

FASTQ文件中每个序列通常有四行：

1. 序列标识以及相关的描述信息，以‘@’开头；
2. 第二行是序列
3. 第三行以‘+’开头，后面是序列标示符、描述信息，或者什么也不加
4. 第四行，是质量信息，和第二行的序列相对应，每一个序列都有一个质量评分，根据评分体系的不同，每个字符的含义表示的数字也不相同。

例如：
@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
++
!''((((+))%%%++)(%%%%).1-+''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

HWI-1KL118	the unique instrument name
98	the run id
C374TACXX	the flowcell id
4	flowcell lane
1101	tile number within the flowcell lane
1247	'x'-coordinate of the cluster within the tile
2191	'y'-coordinate of the cluster within the tile
1	the member of a pair, 1 or 2 (paired-end or mate-pair reads only)
N	Y if the read fails filter (read is bad), N otherwise
0	0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number
TTAGGC	index sequence

关于质量编码格式

质量评分指的是一个碱基的错误概率的对数值。其最初在Phred拼接软件中定义与使用，其后在许多软件中得到使用。其质量得分与错误概率的对应关系见下表：

Phred quality scores are logarithmically linked to error probabilities

:Phred Quality Score:	: Probability of incorrect base call:	:Base call accuracy:
10	1 in 10	90 %
20	1 in 100	99 %
30	1 in 1000	99.9 %
40	1 in 10000	99.99 %
50	1 in 100000	99.999 %

Phred quality scores Q are defined as a property which is logarithmically related to the base-calling error probabilities P.
除了Phred质量得分换算标准，还有就是Solexa标准：

两种换算标准的比较：

P/S换算比较

Relationship between Q and p using the Sanger (red) and Solexa (black) equations (described above). The vertical dotted line indicates p = 0.05, or equivalently, Q ≈ 13.

对于每个碱基的质量编码标示，不同的软件采用不同的方案，目前有5种方案：

• Sanger，Phred quality score，值的范围从0到92，对应的ASCII码从33到126，但是对于测序数据（raw read data）质量得分通常小于60，序列拼接或者mapping可能用到更大的分数。
• Solexa/Illumina 1.0, Solexa/Illumina quality score，值的范围从-5到63，对应的ASCII码从59到126，对于测序数据，得分一般在-5到40之间；
• Illumina 1.3+，Phred quality score，值的范围从0到62对应的ASCII码从64到126，低于测序数据，得分在0到40之间；
• Illumina 1.5+，Phred quality score，但是0到2作为另外的标示，详见http://solexaqa.sourceforge.net/questions.htm#illumina
• Illumina 1.8+

下面是更为直观的表示：

SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS.....................................................
..........................XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX......................
...............................IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII......................
.................................JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ......................
LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL....................................................
!"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~

• S - Sanger Phred+33, raw reads typically (0, 40)
• X - Solexa Solexa+64, raw reads typically (-5, 40)
• I - Illumina 1.3+ Phred+64, raw reads typically (0, 40)
• J - Illumina 1.5+ Phred+64, raw reads typically (3, 40)
  with 0=unused, 1=unused, 2=Read Segment Quality Control Indicator (bold)
  (Note: See discussion above).
• L - Illumina 1.8+ Phred+33, raw reads typically (0, 41)

文件后缀

没有特别的规定，通常使用.fq, .fastq, .txt等
FASTQ格式的序列一般都包含有四行，第一行由@开始，后面跟着序列的描述信息，这点跟FASTA格式是一样的。第二行是序列。第三行由'+'开始，后面也可以跟着序列的描述信息。第四行是第二行序列的质量评价（quality values，注：应该是测序的质量评价），字符数跟第二行的序列是相等的。

FASTQ格式例子：

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
++
!''((((+))%%%++)(%%%%).1-+''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

例如在NCBI看到的FASTQ格式如下：

@SRR001666.1 071112_SLXA-EAS1_s_7:5:1:817:345 length=36
GGGTGATGGCCGCTGCCGATGGCGTCAAATCCCACC
+SRR001666.1 071112_SLXA-EAS1_s_7:5:1:817:345 length=36
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII9IG9IC

FASTQ格式与Fasta格式、GenBank等格式的相互转换