大家好呀！今天给大家介绍一篇2021年6月发表在ONCOIMMUNOLOGY（IF：8.110）上的文章。本文作者基于ccRCC患者的RNA-seq数据构建预后模型，可以准确预测ccRCC患者的总生存期和对抗PD-1的反应。
Development of a novel gene signature to predict prognosis and response to PD-1 blockade in clear cell renal cell carcinoma
构建肾透明细胞癌的预后模型预测患者生存情况和对PD-1阻断的反应
流程图：
结果：
1.数据集的获取和下载
从GEO数据库下载7个ccRCC的RNA-seq数据集，GSE53757,GSE53000,GSE36895,GSE15641,GSE66272,GSE68417和GSE40435。从TCGA数据库下载ccRCC的RNA-seq数据和临床数据。从ArrayExpress数据库下载E-MTAB-1980数据集。
2.鉴定DEGs
本研究共使用266例ccRCC样本和343例癌旁组织进行差异分析鉴定DEGs。
3.鉴定关键模块和核心基因
作者对TCGA数据集的DEGs进行WGCNA分析以鉴定与临床特征有关的关键模块（图1b-1d）。TCGA数据集的临床信息如图1a所示。绿色模块与临床特征的相关性最高（图1e）。模块显著性分析进一步表明绿色模块是与ccRCC患者生存情况最显著相关的模块（图1f）。因此，作者将绿色模块定义为关键模块。根据MCODE分析和PPI网络分析鉴定到49个核心基因。KM分析表明有24个核心基因与OS高度相关。
图1 WGCNA鉴定关键模块
4.构建预后模型
对这24个核心基因进行LASSO回归分析筛选到4个基因：FOXM1,TOP2A,KIF18B和NUF2（图2a）。这4个基因在肿瘤组织中均显著上调表达（图2b）。TMA队列包括348例ccRCC肿瘤组织和癌旁组织（表1）。这4个基因在TMA队列的IHC结果如图2c所示。ccRCC组织中FOXM1,TOP2A和NUF2蛋白水平较高，而KIF18B蛋白水平较低（图2d）。KM分析表明，FOXM1和TOP2A高表达与OS较差有关（图2e）。最终，基于TOP2A和FOXM1构建预后模型，风险打分=（0.693×FOXM1）+（-0.184×TOP2A）。根据风险打分中位数将患者分为高风险组和低风险组。
表1 TMA队列的临床病理特征
图2 构建预后模型
5.预后模型的验证
作者对TCGA队列，E-MTAB-1980和TMA队列验证预后模型的性能。TCGA队列中高风险组的死亡病理较多（图3a），KM分析表明高风险组的OS较差（图3a）。3年，5年和8年的ROC曲线的AUC分别为0.68，0.70和0.70（图3a）。E-MTAB-1980和TMA队列的分析表明高风险组的OS较差（图3b-3d）。
图3 预后模型的验证
6.高风险组与肿瘤分期和病理分期较高有关
高风险组的患者G3和G4期的比例较高（图4a），且病理分期较高（图4b）。对TMA队列来说，FOXM1表达水平与年龄，AJCC分期，肿瘤大小和等级等有关，TOP2A表达水平与等级和肿瘤大小等有关（表2）。图4c为TOP2A/FOXM1表达水平与肿瘤等级的相关性，随肿瘤等级增加，TOP2A和FOXM1的染色强度逐渐增加。
表2 TAM队列TOP2和FOXM1表达与临床病理特征的相关性
图4 风险打分与临床特征的相关性
7.GSEA和GSVA表明预后模型基因与细胞循环过程高度相关
作者对TCGA队列进行GSEA和GSVA分析，排名前3位的显著富集通路如图4d和4e所示。TOP2A和FOXM1高表达组中的基因显著富集细胞周期和同源重复等功能。GSVA分析表明TOP2A和FOXM1高表达组中显著富集细胞周期，同源重组，DNA复杂和错配修复等功能（图4f和4g）。
8.高风险组和低风险组的免疫情况
图5a为高风险组和低风险组ESTIMATE打分和免疫细胞浸润水平的差异。高风险组的免疫打分较高，表明免疫细胞浸润水平较高。高风险组的免疫抑制细胞浸润水平较高。CIBERSORT和IMMUNECELL AI结果表明，高风险组的Tregs和巨噬细胞浸润水平较高（图5b）。
9.高风险组具有免疫抑制表型
为鉴定ccRCC中巨噬细胞和Tregs的浸润水平，作者对TMA队列进行mIHC。结果表明，高风险组巨噬细胞，FOXP3+ Tregs，M2巨噬细胞浸润水平较高（图5c）。高风险组和低风险组的免疫荧光染色结果如图5d所示。以上结果表明高风险组的免疫抑制细胞浸润水平更高。
作者从Tracking Tumor Immunophenotype下载调控癌症免疫循环负相关的基因的表达水平，研究其在高风险组和低风险组的表达水平。结果表明，这些基因在高风险组中上调表达，表明高风险组患者的抗肿瘤免疫活性较低（图5e）。PD-1,CTLA-4和LAG3在高风险组中显著高表达（图5f）。高风险组中趋化因子参与巨噬细胞诱导的免疫抑制过程显著上调（图5g）。
图5 高风险组具有免疫抑制表型
10.低风险组与抗PD-1免疫治疗反应增加有关
为研究风险打分与免疫治疗反应的相关性，作者对156例接受抗PD-1治疗的ccRCC患者进行分析。根据患者治疗后的反应，将患者分为CB，ICB和NCB三组。高风险组和低风险组患者在这三组中的分布如图6a所示。低风险组中CB患者比例较高（图6b），低风险组患者的PFS较好（图6c）。CB和NCB组的TMB和PD-L1表达水平没有差异（图6d和6f）。CB组的PBRM1突变水平更高（图6e）。
图6 低风险组的抗PD-1免疫治疗效果更好
11.体细胞突变分析
高风险组和低风险组的体细胞突变水平如图7a和7b所示。VHL,PBRM1，TTN和SETD2是突变频率最高的基因，高风险组中BAP1的突变频率较高（图7c）。低风险组PBRM1 LOP的频率较高（图7c和7d）。发生PBRM1 LOF的患者OS显著较好（图7e）。多因素Cox回归分析表明细胞循环相关特征和PBRM1突变状态是ccRCC的独立风险因子（图7f）。此外，将PBRM1突变状态与风险打分结合可以提供预后模型的性能（图7g）。
图7 高风险组和低风险图的突变分析
12.基于细胞循环相关特征构建列线图预测OS
对风险打分和临床病理特征进行单因素和多因素分析，构建列线图。多因素分析表明高风险组患者OS较差（图8a）。基于风险打分，AJCC分期，肿瘤大小和Fubrman等级构建列线图，可以预测ccRCC患者的3年，5年和8年的生存情况（图8b）。校准图结果表明列线图的准确性（图8c-8e）。3年，5年和8年ROC曲线的AUC分别为0.89，0.84和0.82（图8f-8h）。
图8 构建列线图
结论：
总的来说，作者构建了一个可以预测ccRCC患者生存的预后模型。并揭示了高风险组和低风险组与细胞周期活化和免疫抑制之间的关系。并基于细胞循环特征构建列线图，可以准确预测ccRCC患者的生存期。