表达质粒构建

1 反应体系：

2*Phanta max master mix：25ul
R：2ul（10uM）
F：2ul（10uM）
cDNA：21ul（稀释过的）

2 反应条件：

95℃ 3min
95℃ 15s
60℃ 15s
72℃ 1000bp/min
(2-4步30个循坏，不能多。）
72℃ 10min
4℃ (持续）

3 琼脂糖1%+1%EB

样品中加10x lodding buffer
样品在负极，120V 40min 电泳
紫外灯，切胶回收DNA。

4胶回收后

按照‘gel kit’试剂盒提取纯化DNA，40ul dd水 60℃预热溶解DNA。

5 酶切

DNA（提取纯化的）：40ul；
5 μL 10x cut smart buffer
1 μL Cla1
1 μL kpn1
ddH2O补至50 μL

5 μg pLKO.1
5 μL 10x cut smart buffer
1 μL Cla1
1 μL Kpn1
ddH2O补至50 μL
37度酶切过夜

6 通过琼脂糖电泳获得线性化质粒，同时进行纯化回收。

DNA需要使用纯化试剂盒直接纯化，质粒需要电泳跑胶纯化（胶中的质粒必须在曝光仪器上观看，紫外容易导致突变）
质粒酶切的时候会出现单链断裂等情况，所以我们需要跑胶，进行胶回收，纯化。质粒需要用50ul水溶解，DNA片段需要使用20ul的水溶解。

7连接

将退火产物与线性化质粒进行T4连接酶连接，连接过夜。

15ul 目标DNA片段（如果使用20ul，则14ul就可以）

2ul 线性化质粒（如果使用50ul，3ul质粒）

2μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer

1μL NEB T4 DNA连接酶

（16度连接过夜）

8转化

[ 基本原理 ]

将质粒 DNA 导入细菌的过程称为转化（ Transformation ）。此感受态细菌细胞在 CaCl 2 低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，见前）。质粒 DNA 与 CaCl 2 形成抗 DNase 羟基 - 磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子（即含有质粒 DNA 的细菌）。钙处理的感受态细胞，一般每微克 DNA 能获得 10 5 ～ 10 6 个转化子。除化学方法转化细菌外，还有电穿孔法（ Electroporation ），其转化率可高达 10 9 ～ 10 10 个转化子 /μg 质粒 DNA 。

[ 器材 ]

1 ．培养皿 2 ．恒温培养箱

[ 试剂 ]

1 ． LB 培养基

2 ．选择性 LB 琼脂培养平板（含氨苄青霉素，终浓度为 50μg/ml ）

3 ．氨苄青霉素 100 mg/ml

4 ．宿主细菌：经 100 mmol/L CaCl 2 处理的感受态细菌 DH5α

[ 操作步骤 ]

• 取 50 μL 大肠杆菌感受态细胞，加入适量质粒（全部的连接产物）冰浴 30 min 后， 42℃ 热激 70 s ，马上放回冰上，冰浴 5 min ；加 1ml LB 培养基（无Amp），于 37℃ 摇床慢摇振荡培养 60 min ；3000rpm 4min离心，倒掉上清，下面的沉淀物混匀涂板。取 50-100 μL 涂在含有氨苄青霉素（ 100 μg/mL ）的 LB 固体培养基上， 37℃ 倒置培养过夜。（如果涂上去的液体过多，则正置1h后倒置。

9 挑克隆

每个样品挑5个克隆、ep管中加10uldd水挑入克隆捶打混匀。取出八连管：
mix ：10ul
Flag-R：1ul ;
GFP-F：1ul ;
克隆混合液：3ul ;

程序
pcr：95 3min
95 15s
56 15s
72 90s
72 10min
4 持续
2-4 30个循环
完成后看切的条带大小，一般跑胶，在皮曝光机器下看，与自己目的蛋白一样大小的kb带出现则提示连接成功。注意marker的选择。

然后将剩余7ul的克隆混合液加入amp的lb培养基800ul的样子在摇床中摇。

跑完胶后发现正确的条带后，将摇床上正确条带的菌群，转移到15ml的摇菌管，摇菌过夜。

10 抽取质粒DNA，送去测序，获得正确组装质粒。

测序引物

先测反向：

pFlag-CMV-R： GCACTGGAGTGGCAACTT（自己合成）
再测正向：
CMV-Forward
21mer 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3（公司有免费通用）