ccRCC独特的基因组特征和免疫微环境特征对治疗反应和预后具有复杂的意义（IF8+）

Integrative Analysis of the Genomic and Immune Microenvironment Characteristics Associated With Clear Cell Renal Cell Carcinoma Progression: Implications for Prognosis and Immunotherapy

与透明细胞肾细胞癌进展相关的基因组和免疫微环境特征的综合分析：对预后和免疫治疗的启示

发表期刊：Front Immunol

发表日期：2022 May 23

doi:10.3389/fimmu.2022.830220

期刊相关信息

一、背景

        透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的主要原因。ccRCC的TNM分期是基于肿瘤的发展，直接影响到治疗方式和预后。局部ccRCC可以通过保肾手术治疗，而晚期ccRCC则难以治疗，预后差，复发率高。最近开发的免疫检查点抑制剂（ICI）显着改善了转移性ccRCC患者的预后，但其中只有少数人获得了显着和持久的益处。因此，确定与 ccRCC 进展和对免疫治疗药物的反应相关的生物学特征可以改善患者评估、治疗选择和预后。

        ccRCC具有相对独特的基因组特征，包括Del(3p)、Amp(5q)和VHL、PBRM1、SETD2和BAP1的体细胞突变。尽管Del(3p)和VHL突变是ccRCC的标志性特征，但这些基因组的改变与临床结果没有明确的联系。相反，Del(9p)和Del(14q)被认为是ccRCC转移和死亡的有力的风险因素。越来越多的证据表明，ccRCC对免疫治疗的反应与CD8 T细胞浸润的程度和PD-L1表达无关，并且不能像在其他一些癌症中那样通过肿瘤突变负荷（TMB）来预测。ccRCC独特的基因组特征和免疫微环境特征对治疗反应和预后具有复杂的意义。

二、材料与方法

1.数据来源

1） TCGA队列：ccRCC患者的体细胞突变、体细胞拷贝数改变（SCNAs）、基因表达和临床信息的数据来自TCGA数据库（n=348）

2） ICGC队列：来自ICGC门户网站的数据包括ccRCC患者的体细胞突变、基因表达和临床信息（n=72）

3） 从抗PD-1疗法临床试验队列Checkmate 009和Checkmate 025（分别为12和75名患者）中获得了归一化的基因表达数据和已公布的转移性ccRCC患者的临床信息

4） 肾脏乳头状细胞癌（KIRP）和肾嫌色细胞癌（KICH）患者的临床信息从TCGA数据库中获得

2.实验流程

1） 与肿瘤表型的预后相关性：生存分析；通过Cox比例风险（CoxPH）模型进行单变量和多变量分析

2） 表型间突变的比较：双侧的Fisher's精确检验比较了各种表型的突变频率；通过Mann-Whitney U检验比较每两个表型之间的明显不同的突变

3） 表型间SCNAs的比较

4） SCNAs和靶基因转录之间的关系分析：基础表达水平和靶基因与SCNAs之间以及基因表达与肿瘤进展之间的相关性分析

5） 微环境细胞丰度和免疫调节剂的量化：CIBERSORT、MCPCounter、quantTIseq和ImmuCellAI被用来量化TCGA和ICGC队列中ccRCC样本的肿瘤浸润性免疫细胞

6） 免疫原性指标的计算：TMB、基因组改变部分（FGA）、新抗原负荷、肿瘤内异质性（ITH）评分、癌睾丸抗原（CTA）评分和同源重组缺陷（HRD）评分被用来衡量肿瘤免疫原性

7） 差异表达和功能富集分析：DESeq2和limma R软件包，采用默认设置进行TCGA和ICGC队列中表型间以及免疫治疗队列中CB和NCB组间的差异基因表达分析；基因集富集分析（GSEA）；富集分析，应用ssGSEA来评估样本的通路富集分数

8） 统计分析和数据可视化

三、实验结果

01 - 侵袭性和转移是ccRCC死亡和复发的独立风险因素

        生存分析结果显示，AJCC分期可以预测患者的OS和ccRCC复发（图1A，C），但不能区分I期和II期患者的OS和RFS。OS和RFS在ccRCC表型之间有明显差异（图1B，D）。

图1    评估TCGA队列中ccRCC的阶段和表型的预后价值

        单变量回归分析显示，侵袭性和转移性表型的死亡和复发风险明显高于局部表型，多变量回归分析证实它们是ccRCC死亡和复发的独立危险因素（图1G）。随后，评估了ccRCC表型对OS和复发的预测功效。时间依赖性ROC分析显示，ccRCC表型对OS和5年内复发具有良好的预测能力，与AJCC分期相似（图1E）。进一步评估了TNM分期对KICH和KIRP预后的预测能力，因为它们使用了与ccRCC相同的一套分期标准。有趣的是，AJCC分期不能很好地区分KICH和KIRP的良好和不良的OS或复发，其对OS或复发的预测能力很差，在5年内不稳定（图1E, F）。总的来说，ccRCC在肿瘤进展表型之间表现出比其他常见肾癌更明显的生存和复发差异。侵袭性和转移性特征影响了ccRCC患者的治疗方式选择、预后和复发。因此，有必要进一步研究影响ccRCC进展的相关因素。

02 - 不同的基因组改变景观驱动ccRCC的进展

        在TCGA和ICGC队列的综合数据中，常见的复发性突变（>10%）包括VHL、PBRM1、SETD2、TTN和BAP1，其中只有SETD2在不同表型之间有明显差异（图2A、B）。RYR3和PTEN在低频突变（<10%）中差异明显，但在两个队列中表现出不一致。作者评估了ccRCC中的12个驱动体细胞突变，结果显示只有SETD2突变与ccRCC的进展有关（图2A，B），这意味着大多数驱动突变可能与肿瘤发生而不是ccRCC的进展密切相关。然而，生存分析显示，SETD2突变与预后无关，而BAP1突变则与预后不良有关。这一发现可以解释为它们影响肿瘤进展和预后的潜在机制存在很大差异。进一步的多重比较试验发现，SETD2突变可以区分局部和非局部ccRCC，但不能区分侵袭性和转移性ccRCC。有趣的是，上述分析并没有发现只存在于局部ccRCC的体细胞突变。

图2    ccRCC表型中的基因组改变概述

        与体细胞突变相反，SCNAs常常影响一系列的基因。在TCGA队列中，Del(3p)和Amp(5q)是ccRCC中最常见的复发性SCNAs（图2C、3），在表型中的比例相似，与预后没有关联（图3），这意味着它们可能只是肿瘤发生的驱动因素。高频臂级SCNAs在侵袭性和转移性ccRCC中更为常见（图3）并与预后不良有关。与体细胞突变类似，这些SCNAs不能有效区分侵袭性和转移性ccRCC，表明它们可能驱动ccRCC的进展，但不是远处转移。此外，除了局部ccRCC外，在所有表型中都发现了显著发生的SCNAs（图2C、3）。进一步分析发现，9号染色体上的缺失与4号和14号染色体上的缺失之间有适度的正相关（图3）。

图3   TCGA队列中CCRCC的复发性和差异性SCNAs及其表型之间的相关性。

        为了了解SCNAs驱动ccRCC进展的潜在机制，作者分析了伴随SCNAs和SCNAs水平的已知基因的转录与ccRCC进展之间的相关性。发现HIF1A的转录水平与正常组织相似，受SCNAs或表型的影响很弱（图4）。DAPK1、FBP1和TSC1是Del(9q)上的知名靶点，其转录水平受Del(9q)的影响很大。其中，只有TSC1与肿瘤的进展密切相关（图4）。此外，在两个队列中观察到ccRCC中FBP1的平均表达水平低于正常组织，而TSC1的情况则相反。CDKN2A和CDKN2B是位于9p21.3的著名肿瘤抑制因子，在ccRCC中的转录水平比正常组织高。这些并不受SCNAs和肿瘤进展的影响（图4）。9p21.3的另一个肿瘤抑制因子MTAP的表达与SCNAs和肿瘤进展密切相关，尽管其平均水平与正常组织相似（图4）。综合来看，MTAP似乎是Del(9p21.3)在ccRCC中的一个更合适的目标。9p23的PTPRD在ccRCC的表达低于正常组织，与SCNAs和肿瘤进展相关性较弱。

图4    SCNAs与靶基因之间转录调控关系的结果

03 - ccRCC发展过程中免疫逃逸模式的动态变化

        作者使用四种免疫浸润定量工具比较了不同ccRCC表型中肿瘤浸润免疫细胞的估计水平。在两个队列中，CD8+ TILs和Tregs在侵袭性和转移性ccRCC中显示出更高的丰度。B细胞、自然杀伤（NK）和CD4+细胞的水平在肿瘤发展过程中没有明显变化（图5A）。然而，巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的估计水平在队列和量化工具之间差异太大，无法评估。作者还比较了局部ccRCC和正常组织之间的免疫细胞水平，结果显示早期ccRCC已经显示出较高水平的CD8+TILs、CD4+TILs、Tregs、NK细胞、DCs和巨噬细胞（图5A）。此外，侵袭性和转移性ccRCC的免疫抑制分子表达较高，包括PDCD1和LAG-3，这间接反映了TILs的耗尽（图6）。经典的免疫抑制细胞因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、吲哚胺2,3-二氧酶（IDO）和白细胞介素（IL）-10，以及效应性T细胞杀伤活性指标，包括GZMB和细胞溶解活性，在ccRCC进展期间没有变化（图6）。然而，侵袭性和转移性ccRCC的CD27、IFNG和CXCR3的表达水平很高（图6），它们与抗肿瘤免疫激活有关。

图5    ccRCC表型间免疫细胞和免疫原性指标的差异

图6    ccRCC表型之间以及肿瘤与正常组织之间免疫调节剂的差异

        接下来作者研究了ccRCC进展中内在免疫逃逸的潜在机制。结果显示，侵袭性和转移性ccRCC的CTA评分、HRD评分和ITH评分都明显高于其他表型，而所有表型的TMB、FGA和新抗原的水平相似（图5B）。其中，只有CTA评分在侵袭性和转移性ccRCC之间有明显差异。相应的生存分析显示，CTA评分、HRD评分和ITH评分高的ccRCC患者呈现较短的无复发和总生存时间。此外，所有MHC相关的抗原呈递分子在ccRCC的表型中是相似的，这是SCNAs无法解释的结果（图6）。作者评估了免疫原性指标和外源性免疫逃逸之间的相关性，以研究侵袭性和转移性ccRCC的高免疫原性是否是免疫细胞浸润的一个促成因素。令人惊讶的是，CTA评分、ITH评分和HRD评分与免疫细胞浸润、抗肿瘤免疫活性或免疫检查点分子的表达没有明显的相关性（图S4A）。

图S4

04 - 与ccRCC的侵袭性和转移性相关的生物过程

        GSEA显示，侵袭性和转移性ccRCC中上调的基因富集在与免疫反应和细胞周期（图7A）相关的途径中。值得注意的是，只有细胞周期途径在侵袭性和转移性ccRCC之间有明显差异。此外，在TCGA队列中，侵袭性和转移性ccRCC下调的基因富集的途径与氧化磷酸化有关；然而，这在ICGC队列中没有观察到。

图7    ccRCC中表型间的差异生物学过程以及基因组改变与免疫相关指标的相关性

        作者分析了上述生物过程的ssGSEA得分与外在和内在的免疫逃逸相关指标之间的相关性，以探讨这些生物过程是否与ccRCC的免疫微环境特征有关。由于IFN-γ反应通路和异体移植排斥通路之间有非常强的相关性（图S4B），在合并它们的基因集后重新计算了ssGSEA得分，命名为免疫浸润得分，E2F靶点通路的ssGSEA得分被定义为细胞周期得分。免疫浸润评分很好地区分了局部和非局部ccRCC，并与ccRCC相关的免疫微环境特征有明显的正相关，包括CD8+TILs和Tregs的浸润，免疫刺激因子PDCD1和LAG-3，以及免疫刺激因子CD27（图7B；图S4C）。细胞周期评分区分了侵袭性和转移性ccRCC，但与上述外在的免疫逃逸特征没有关联（图7B）。相反，它与CTA评分和HRD评分有很强的正相关关系，而免疫浸润评分与免疫原性指标的相关性很弱（图S4C）。由于ccRCC的进展伴随着基因组的改变和免疫微环境特征的动态变化，探讨了ccRCC的基因组改变和免疫浸润之间的关系。结果显示，ccRCC中所有复发性或低频的差异性突变都与ccRCC进展相关的免疫浸润评分和免疫微环境特征无关。在SCNA水平上，免疫浸润评分和Del(14q)之间有适度的正相关，而细胞周期评分与两种差异性SCNA没有明显的相关性（图7C）。总的来说，免疫浸润评分反映了ccRCC进展过程中免疫微环境特征的动态变化，而细胞周期评分反映了ccRCC的侵略性和转移能力。

05 - 基因组拷贝数改变是ccRCC免疫微环境变化的一个驱动因素

        作者进一步探讨了Del(14q)驱动ccRCC免疫微环境变化的潜在机制。选择了映射到14q染色体上的基因，并根据它们与免疫浸润分数的相关性进行排序，随后进行了GSEA分析。结果显示，这些基因只在VEGFA-VEGFR2信号通路中富集，但是并不明显（图7D）。除HSP90AA1和RHOJ外，该通路中前沿基因表达水平的改变可由Del（14q）解释（图7D）。此外，14q染色体上的HIF1A和2p染色体上的HIF2A被认为是VEGFA-VEGFR2信号传导途径的上游调节器。相关性分析显示HIF1A和HIF2A与VEGFA-VEGFR2通路的前沿基因之间有明显的相关性，除了HSP90AA1和RNP（图7D），HIF1A的表达可以用Del（14q）来解释（图S5A）。根据14q染色体的缺失状态将ccRCC分为两组，并对它们之间的差异表达基因进行富集分析，以进一步证实Del(14q)与ccRCC免疫微环境改变之间的相关性。结果显示，Del(14q)组中被上调基因富集的大多数途径都与免疫反应有关（图S5B）。此外，根据其转录水平和相应拷贝数之间的相关性对映射到14q的基因进行排序，并随后进行GSEA分析。有趣的是，VEGFA-VEGFR2信号通路在这些基因中明显富集（图7E）。Del(14q)引起的它们的表达下调可能导致VEGFA-VEGFR2通路的下调。

图S5

06 - 细胞周期通路与ccRCC的肿瘤进展和对免疫治疗的反应有关

        作者重新评估了ccRCC的进展和免疫治疗反应之间是否存在关联，寻找相关的新生物途径或标记物。首先，对免疫治疗队列中的CB组和NCB组进行了差异基因表达分析。GSEA分析显示，CB组的上调基因富集于免疫相关的途径，而下调基因主要富集于细胞增殖和氧化磷酸化途径（图8A、9）。随后，提取了每个途径中的前沿基因，并分析了ssGSEA评分对每个途径的免疫治疗反应疗效的预测能力。结果显示，IL-2 STAT5信号通路和mTORC1信号通路在Checkmate 009和Checkmate 025队列中有很强的预测能力（图8B）。

图8    与免疫治疗反应相关的生物学途径。

图9    免疫治疗队列中CCRCC的CB组和NCB组差异基因的火山图。

        这些结果表明，与ccRCC进展相关的生物途径与免疫治疗反应之间存在关联。进一步的相关性分析显示，细胞周期评分与免疫治疗反应相关的E2F靶点和G2M检查点通路评分密切相关，而免疫浸润评分与IL-2-STAT5信号通路评分适度相关（图8C）。有六个基因同时出现在两个基因组中，在标志基因组中，它们只出现在与细胞增殖有关的途径中（图8D）。此外，在两个队列中，由这六个基因组成的ssGSEA评分在转移性ccRCC中明显高于非转移性ccRCC，在免疫治疗队列中，NCB组高于CB组（图10A）。此外，发现在免疫治疗队列中，免疫浸润评分和任一免疫相关途径之间没有重叠的基因，这与两个队列中ccRCC的进展没有关系（图10B-D）。

图10    ssGSEA分数差异的图谱图S4

四、结论

        总之，这项研究为驱动ccRCC进展的内在机制和免疫微环境的相关变化提供了重要线索。此外，参与免疫调节的基因组改变和与免疫治疗反应相关的生物途径显示出潜在的临床价值，为制定ccRCC患者的精确治疗策略和有效预测方案提供了新的见解。