[生命科学] 生物基础实验之三引物检测突变体

三引物检测转基因植物

Ti质粒和T-DNA

Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

设计引物

PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。打开网站http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html。在白色方框处输入T-DNA编号即可获得两端引物。

中间引物通常是通用的，如我要验证的基因是SAIL_1238_XXX，中间引物则是SAIL）。然后把得到的信息发送给公司。收到的引物如图：

离心管中引物为粉末状，非常细小。因此，我们拿到引物后需要离心1分钟，即可看到轻微沉淀。再按离心管上要求，图2左侧显示加51x10μL的buffer或者超纯水，右侧引物显示加48X10μL的buffer或者超纯水（一般我们会稀释10倍）。放入-20℃冰箱冷冻保存。图3可以看到离心管盖子上分别标记了LP和RP，防止操作错误。

原理

T-DNA本身的长度约为17kb，而两端的引物本身长度为小于100bp，因此插入之后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。如果，LP和RP这对两端的引物能扩出来，说明中间引物没有插入进去，该植株为野生型(wt)，由于野生型不包含目的基因，因此BP和RP也无法扩出PCR。如果LP和RP两端引物不能扩增出来，但BP和RP能扩增出来，则说明该位点插入成功，为纯合基因型（aa）。如果两端引物能扩增出来，且中间引物与末端引物也能扩增出来条带，说明该基因型为杂合基因型（Aa）。为什么是中间引物和反向引物扩增？因为DNA序列是有方向的。如正向引物往右边，反向引物往左边，中间引物方向为右，因次中间引物只能与反向引物进行扩增。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够很容易地从群体中区分出纯合突变体。

	LP+RP	BP+RP	说明
野生型	有大片段	无	BP为中间引物
杂合型	有大片段	有小片段	LP为正向引物
纯合型	无	有小片段	RP为反向引物

实验步骤

实验主要分为两个部分：DNA的提取和PCR扩增（参考之前发表实验方法）。

这里需要注意的是（1）在提取植物DNA时，如果某一批种子播种较多，可以进行混叶检测。例如：每个基因型的种子种植物20株，为了检测这一批次基因，可以将20个单株叶片都取一点混合到同一个离心管提取DNA，得到的结果更具有说服力。（2）在PCR扩增实验，实验试剂包括7.5μLMaster Mix 溶液，5.5μL蒸馏水，引物各0.5μL以及1μL 模板（植物的DNA）。或者是5μLMaster Mix 溶液，引物各0.5μL以及4μL模板。

在实际操作过程中，我们很难准确将0.5μL的引物提取出来。因此，在样品数较大的情况下，我们可以先混合溶液。比如我们需要验证10个植物突变体，也就是说一共需要提取0.5*10=5μL。这样既方便我们提取溶液，加快速度，又能减少误差，保证准确性。