文献分享 C-C 模体化学因子受体2的抑制通过恢复免疫细胞格局减轻肝纤维化

C-C 模体化学因子受体2的抑制通过恢复免疫细胞格局减轻肝纤维化
C-C motif chemokine receptor 2 inhibition reduces liver fibrosis by restoring the immune cell landscape
发表于 International Journal of Biological Sciences IF = 9.2

摘要
在肝脏中，细胞外基质（ECM）蛋白的积累导致肝纤维化和晚期肝硬化。C-C 模体化学因子受体 2（CCR2）是治疗肝纤维化的一个有吸引力的靶点。然而，目前对于CCR2抑制如何减少ECM积累和肝纤维化的机制进行了有限的研究，而这正是本研究的重点。通过对野生型小鼠和Ccr2缺失小鼠（Ccr2-/-）进行四氯化碳（CCl4）诱导的肝损伤和肝纤维化，发现CCR2在小鼠和人类纤维化肝中上调。药理学上使用Cenicriviroc（CVC）抑制CCR2，在预防和治疗过程中减少了ECM积累和肝纤维化。在单细胞RNA测序（scRNA-seq）中，CVC通过恢复巨噬细胞和中性粒细胞的格局来减轻肝纤维化。CVC的使用和CCR2的删除也可以抑制炎性FSCN1巨噬细胞和HERC6中性粒细胞在肝脏中的积累。途径分析表明STAT1、NFκB和ERK信号途径可能参与了CVC的抗纤维化效应。一致的是，Ccr2缺失降低了肝脏中磷酸化的STAT1、NFκB和ERK。在体外实验中，CVC可以通过失活STAT1/NFκB/ERK信号途径，在巨噬细胞中对关键的促纤维化基因（Xaf1、Slfn4、Slfn8、Ifi213和Il1β）进行转录抑制。总的来说，本研究描绘了CVC通过恢复免疫细胞格局减轻肝纤维化中ECM积累的新机制。CVC可以通过失活CCR2-STAT1/NFκB/ERK信号途径抑制促纤维化基因的转录。

Cenicriviroc（CVC）是一种口服药物，是CCR2/CCR5的双重拮抗剂，最初是为治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染而开发的。实验证明，在小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和与酒精相关的肝病（ALD）中，CVC通过抑制Ly-6Chigh单核细胞和巨噬细胞的招募，从而减轻了肝脏脂肪变性和纤维化。

结果

通过CVC预防性药理学CCR2抑制减少肝纤维化

相对于CCl4组，CVC显著抑制了CCR2免疫细胞和CCR2蛋白水平，通过免疫荧光和Western blot分析得出（图1A-B）。CCl4引起的外周血CD45/CCR2免疫细胞数量的增加也被CVC显著抑制（图1C）。一致地，当使用CVC进行预防性治疗时，CCl4引起的肝纤维化和肝星状细胞（HSC）激活也显著减轻，通过减少纤维化面积和胶原I、αSMA蛋白水平来量化（图1A-B）。同时，三组组织的H&E染色显示，CVC没有对其他器官，包括心脏、肾脏、肺脏、胃、肠和脾脏，造成损害。

通过CVC治疗性药理学CCR2抑制来减轻肝纤维化

为了进一步验证CVC对已存在的肝纤维化的影响，CVC治疗是在CCl4注射后的3周进行的（图2A）。CCl4组中增强的CCR2蛋白水平和CCR2免疫细胞在CVC治疗后显著减少（图2A-C）。与预防性给药类似，通过CCl4注射诱导的ECM积累和HSC激活，通过增加纤维化面积和胶原I、αSMA蛋白水平进行量化，也在3周CVC治疗后显著改善（图2A-B）。

CVC在小鼠纤维化肝中恢复免疫细胞格局
上述结果表明，促炎和促纤维化信号通路参与了CVC的抗纤维化作用。接下来，应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)对非实质细胞（NPCs）进行分析，以阐明CVC预防性治疗如何在单细胞水平上改善肝纤维化（图3A）。
在巨噬细胞的6个聚类中，与正常组相比，CCl4组观察到聚类1和聚类6的比例增加，而聚类2-5的比例减少（图3G）。然而，CVC治疗消除了促炎聚类6（Fscn1）比例的增加和抗炎聚类2（Xcr1）比例的减少（图3G，支持图S5A-B）。此外，通过伪时间分析获得了不同分化状态的巨噬细胞群体（图3H）。与正常组相比，CCl4组观察到伪时间状态1的百分比增加和伪时间状态2和3的百分比减少。然而，CVC治疗未恢复这些变化（图3H）。

通过CVC抑制炎性巨噬细胞和中性粒细胞的积聚

通过确定巨噬细胞和中性粒细胞的分布，研究了巨噬细胞和中性粒细胞的紊乱稳态。在CVC预防性小鼠模型中，通过H&E染色确定，CCl4组比正常组观察到更广泛的炎性细胞浸润（图4A）。一致地，在CCl4组的纤维化区域观察到增强的F4/80巨噬细胞和髓过氧化物酶（MPO）中性粒细胞，与正常组相比（图4A）。FSCN1和HERC6是通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）确定的小鼠促炎性巨噬细胞聚类6和中性粒细胞聚类4的新细胞标记物 。CCl4给药诱导了FSCN1炎性巨噬细胞和HERC6炎性中性粒细胞的增加。与正常组相比，CCl4组的F4/80、FSCN1、MPO和HERC6蛋白水平也显著增强（图4B）。然而，预防性CVC给药显著废除了上述炎性巨噬细胞（F4/80、FSCN1）和炎性中性粒细胞（MPO、HERC6）的增加（图4A-B）。在CVC治疗小鼠模型中也获得了类似的结果。通过H&E染色，F4/80、FSCN1、MPO和HERC6的IF/IHC和WB在CCl4组中增强的肝脏炎性巨噬细胞和炎性中性粒细胞积聚也被CVC治疗显著废除（图4C-D）。总之，CVC在预防和治疗小鼠模型中抑制了炎性巨噬细胞和中性粒细胞的积聚。

肝损伤后 CCR2 敲除对巨噬细胞和中性粒细胞募集的减弱

在肝纤维化中，巨噬细胞和中性粒细胞的招募在肝损伤后很早就发生。因此，在Ccr2-/-小鼠中建立了急性肝损伤小鼠模型，以确认CCR2阻断对巨噬细胞和中性粒细胞招募的保护作用。

CVC的作用机制： CVC通过调节巨噬细胞和中性粒细胞的免疫细胞格局，抑制炎性巨噬细胞和中性粒细胞的积聚，从而减轻慢性胰腺炎引起的肝纤维化。
CCR2的作用： CCR2是慢性胰腺炎中巨噬细胞和中性粒细胞的关键调控因子。CCR2的抑制通过减少巨噬细胞和中性粒细胞的招募，对防止肝损伤后的炎症反应产生积极效果。
免疫细胞的分布： 在慢性胰腺炎中，巨噬细胞和中性粒细胞早期被招募。CVC预防性和治疗性应用均显示出对炎性巨噬细胞和中性粒细胞招募的抑制作用。
蛋白水平变化： 通过蛋白水平的检测，研究确认了巨噬细胞和中性粒细胞标记物的变化，如F4/80、FSCN1、MPO和HERC6，这些标志物的增加与肝纤维化相关。

CVC恢复免疫细胞景观的潜在机制
为进一步探究CVC改善肝脏炎性巨噬细胞和中性粒细胞积累的潜在机制，对scRNA-seq进行了DEGs、GO富集和KEGG通路分析。CVC 可能通过 JAK-STAT1、TNF-NFκB 和 MAPK 信号通路改善炎性巨噬细胞和中性粒细胞积累以及肝纤维化。

CVC治疗抑制小鼠肝脏和巨噬细胞STAT1/NFκB/ERK信号通路

1. 信号通路的抑制：
   CVC在scRNA-seq和大量RNA测序中均抑制了JAK-STAT、TNF-NFκB和MAPK-ERK等纤维化信号通路。因此，研究检查了CCR2与这些信号通路在小鼠肝脏中的相互关系。与橄榄油组相比，CCl4诱导的肝损伤组中磷酸化STAT1（p-STAT1）、磷酸化NFκB-p65（p-NFκB）和磷酸化ERK（p-ERK）的蛋白水平显著增加（图7A）。然而，Ccr2基因敲除显著抑制了受损肝脏中增加的p-STAT1、p-NFκB和p-ERK水平（图7A）。这些结果表明，CCR2的阻断可能通过失活JAK-STAT、TNF-NFκB和MAPK-ERK信号通路来减轻炎性巨噬细胞和中性粒细胞的积聚以及肝纤维化。

2. CVC在信号通路中的作用：
   在Raw264.7小鼠巨噬细胞系中，CVC在体外应用以探究其对这些信号通路的分子相互作用效应。LPS是炎性巨噬细胞的典型刺激剂。与车辆处理相比，LPS刺激显著增加了磷酸化STAT1、磷酸化NFκB和磷酸化ERK的蛋白水平（图7B）。这些增强的磷酸化STAT1、磷酸化NFκB和磷酸化ERK水平在CVC处理的细胞中显著抑制（图7B）。此外，STAT1抑制剂nifuroxazide、NFκB抑制剂celastrol和MEK抑制剂AZD6244的处理也分别降低了磷酸化STAT1、磷酸化NFκB和磷酸化ERK的蛋白水平（图7B）。这些结果表明CCR2的阻断可能通过失活JAK-STAT、TNF-NFκB和MAPK-ERK信号通路来减轻炎性巨噬细胞和中性粒细胞的积聚以及肝纤维化。
   STAT1 抑制剂 Nifuroxazide： STAT1（Signal Transducer and Activator of Transcription 1）是一种参与调节免疫和炎症反应的蛋白质。Nifuroxazide是一种被用作STAT1抑制剂的化合物，它可能通过抑制STAT1的活性来调控与其相关的信号通路。

NFκB 抑制剂 Celastrol： NFκB（核因子 kappa B）是另一个重要的信号传导分子，参与调节炎症和免疫反应。Celastrol是一种被用作NFκB抑制剂的天然化合物，它可能通过抑制NFκB的活性来影响相关的信号通路。

MEK 抑制剂 AZD6244： 如前所述，AZD6244是一种MEK（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase）抑制剂，通过抑制MEK活性来调节MAPK/ERK信号通路。

3. 基因表达水平的验证：
   在巨噬细胞的scRNA-seq中，CVC抑制了Xaf1、Slfn4、Slfn8、Ifi213和Il1β的表达。研究验证了CVC是否能够通过JAK-STAT1、TNF-NFκB和MAPK-ERK信号通路抑制这些基因在Raw264.7小鼠巨噬细胞中的表达。结果显示，在LPS刺激下，与车辆处理相比，Xaf1、Slfn4、Slfn8、Ifi213和Il1β的mRNA水平在巨噬细胞中显著升高（图8A）。然而，这些上调的基因在CVC处理的细胞中显著下调（图8A）。此外，由LPS诱导的Xaf1、Slfn4、Slfn8、Ifi213和Il1β的增强mRNA水平也受到了STAT1抑制剂nifuroxazide、NFκB抑制剂celastrol和MEK抑制剂AZD6244的抑制（图8A）。一致地，LPS诱导的XAF1和SLFN8蛋白水平的增加也受到了STAT1、NFκB和MEK抑制剂的抑制（图8B）。