CRISPR/Cas 9：载体构建（二）

1，电子图谱的酶切

将下载的pX330序列用Clone Manager打开，点击小剪刀，输入BbsI,点击OK，

Fig1.PNG

结果可以看到，BbsI这种IIs型酶将pX330切为两个片段，一个22bp，另一个8462bp。为什么是两个片段而不是一个大片段呢？因为这个质粒有BbsI两个酶切位点。见上一节https://www.jianshu.com/p/f5ce545a65e6

Fig2.PNG

选择22bp的片段，点击Use Now，OK，Sequence，显示如图序列，

Fig3.PNG

就是这条片段需要替换为你的靶序列。可以看到5'粘性末端CACC和AAAC，这就是上一节在你靶序列上加的碱基序列。

2.1，质粒的酶切

拿到引物和pX330质粒后，需要酶切和连接才能将靶序列替换上去。

2.2，引物的拟合

引物是单链的DNA，要变为双链才能做连接。拟合就是将两条单链DNA通过碱基互补配对变为双链的过程。
拟合分为两步：一、两条引物加到buffer中，94℃变性10 min；二、冷却至室温。
接下来就是拟合好的片段和酶切好的pX330骨架做连接了。