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早啊，胖友们，今天小编跟大家分享的是一篇4月份发表在OncoImmunology (IF=5.869)杂志上的文章。近些年，免疫治疗疗效的影响因素一直是研究热点，单细胞测序也是越来越受欢迎，这篇文章就很好的将二者进行了结合，从细胞-细胞互作的角度去分析肿瘤对抗PD-1治疗不同的应答机制。
数据
抗PD-1治疗相关的scRNA-seq数据集(GSE123814)和bulk-RNA 测序数据集(GSE78220, GSE91061, PRJEB23709, GSE145996)都下载自GEO数据库。scRNA-seq数据包含了治疗前后配对的基底细胞癌(BCC)样本，数据集中的11名患者均接受了抗PD-1药物派姆单抗或西米单抗的治疗。
方法
（1）处理单细胞测序数据用到的软件是Cell Ranger和Seurat，然后使用PCA进行降维，UMAP用于数据集的可视化。
（2）基于Seurat识别差异表达基因，特定细胞类型间的GSVA通过相应R包完成。
（3）接下来，根据已发表研究对细胞进行注释，并最终聚集成18个簇(tumor_1，tumor_2，2个CD4 + T 细胞簇，3 个CD8 + T细胞簇，增殖T 细胞, 内皮细胞，黑色素细胞，肌成纤维细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，树突状细胞，浆细胞样树突状细胞，2个B细胞簇和1个NK细胞簇)。
（4）细胞-细胞互作得分通过CellPhoneDB计算所得，设置阈值为矫正p < 0.05，筛选出两两细胞类型间显著的配体-受体互作对。
（5）作者将scRNA-seq数据集分成四组：治疗前有应答，治疗后有应答，治疗前无应答和治疗后无应答。然后计算了每组细胞对的总互作得分，以及各组间总互作得分的比例。
（6）利用Mann-Whitney U检验识别在治疗前应答组和治疗前无应答组间存在显著差异的配体-受体对，并计算了应答组/无应答组互作得分的ratio值，治疗前/治疗后互作得分的ratio值，以及应答组同无应答组之间的相对ratio值。（7）将通过比较治疗前有应答者和无应答者的scRNA-seq数据识别出的配体/受体基因，分别同两个已有研究筛选出的差异表达基因取交集，以挖掘治疗前与应答相关的配体/受体对，并用多个数据集进行验证。
（8）利用Monocle3对970个配体-受体基因对进行轨迹分析。
图1. 研究总括
结果
治疗前有应答和无应答者细胞互作的不同
根据治疗前有应答者和无应答者总互作得分的比值(图2.c)，作者发现同应答者相比，无应答者中的CD4 T细胞、激活的CD8 T细胞、NK细胞与其他细胞的相互作用多。图2.d展示了有应答和无应答者中特定配体-受体互作对的比较结果，在有应答者中，WNT5A、TNF和NRP等相关的互作对水平较低，而SELE、MDK和ICAM1等相关的互作对水平较高。在对配体/受体对和已有研究识别出的DEGs取交集后，筛选出WNT5A-PTPRK, EGFR-AREG, AXL-GAS6和ACKR3-CXCL12作为与治疗前应答相关的配体-受体对(图2.e)。
图2. 治疗前有应答者和无应答者的比较
有应答者和无应答者治疗前后的相对差异
接受治疗后，同无应答者相比，有应答者中总的来说，CD4 T细胞/激活的CD8 T细胞/肌成纤维细胞/NK细胞/浆细胞/增生性T细胞与其他细胞间的互作水平相对上调，而B细胞/CAFs/内皮细胞/巨噬细胞与其他细胞之间的互作水平相对下调(图3.g)。
图3.应答者和无应答者治疗状态的差异
接下来，作者将配体/受体基因对同一项已有研究筛选出的在有应答和无应答者中治疗前后状态存在差异的2000多个差异基因取了交集，并列出了相对比值>2或<0.5的特定配体-受体对(图4)。
图4. 特定配体-受体对的相对差异
然后，Mann- Whitney U检验被用来识别显著差异的配体/受体对。最后，SELE-SELPLG、CXCR3-CCL19、CXCL12-CXCR3、CCL4- SLC7A1、TNF-TNFRSF1A、TNF-FAS、TNFSF10-TNFRSF10D、THBS1-a3b1 complex和EGFR-AREG这些互作对被筛选为与治疗反应相关(图5)。其中，CCL19-CXCR3/CCRL2互作在有应答者中相对上调；在有应答者的激活的CD8 T细胞和其他细胞之间的互作中，与TNF相关的配体受体对表达水平大幅提高；在无应答者的CAFs/内皮细胞/巨噬细胞/肌纤维母细胞/肿瘤细胞与肿瘤细胞之间的互作中，THBS1- a3b1复合物相对下调。
图5. 治疗反应相关的互作对
此外，研究发现CAFs和肌成纤维细胞在抗PD-1治疗中发挥着一定作用。CAFs与其他细胞之间的FN1和整合素互作在无应答者中显著上调，肌成纤维细胞和其他细胞之间的这些互作在有应答者中也显著上调。
细胞轨迹分析
研究基于970个配体-受体基因使用Monocle3对有反应和无反应者中的所有细胞做了进化轨迹分析，发现细胞间的配体-受体表达在反应者和无反应者之间存在差异。衰竭CD8 T细胞显著分成几个分支，其中一些接近其他CD8 T细胞，而其他接近CD4 T细胞和调节T细胞，表明了它们表达模式的相似性(图6.a)。研究还发现，应答者中有相当比例的肿瘤特异性CD8 T细胞共表达CD39和CD103，治疗后比例进一步增加，然而在无应答者中，这些肿瘤特异性的CD8 T细胞数量和比例非常低(图6.b)。根据配体-受体表达模式的改变方式，作者将这些特异性细胞分成了四类(图6.c)，并分析了它们配体-受体共表达模式以及GO通路富集的不同(图6.d-e)，发现CD39和CD103的共表达水平在分支1细胞中最高。
图6. 所有细胞类型的轨迹分析
预测模型的验证
研究利用XGBoost开发了预测模型，来检测“治疗前应答相关的配体-受体对”和“治疗应答相关的配体-受体对”是否能够预测抗PD-1治疗的反应。作者使用了两个黑色素瘤数据集，患者接受了抗PD-1治疗，AUC值均达到了0.8(图7)。
图7. 结果验证
今天的分享就到这里了，have a nice day!