胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，预后也很差。近年来，免疫治疗在人类恶性肿瘤中得到了广泛研究，然而胶质瘤的“冷免疫”特性使得仅有少数患者受益于免疫治疗。当下研究热度着眼于对胶质瘤和免疫系统之间复杂相互作用的理解，以发挥胶质瘤免疫治疗的效果。2021年4月发表在Frontiers Oncology上一篇文章“Glioma-Associated Stromal Cells Stimulate Glioma Malignancy by Regulating the Tumor Immune Microenvironment”（IF：6+）对胶质瘤相关基质细胞（GASC）作为胶质瘤预后的标志物的潜在机制进行了探讨。
英文缩写：
GASC，glioma-associated stromal cell 胶质瘤相关基质细胞
TCGA,The Cancer Genome Atlas 癌症基因组图谱
CGGA,Chinese Glioma Genome Atlas 中国胶质瘤基因组图谱
HGG,high-grade glioma; 高级别胶质瘤
ssGSEA，Single-sample Gene Set Enrichment Analysis algorithm 单样本基因集富集分析算法
PCA，Principle Component Analysis 主成分分析
DEGs,differentially expressed genes; 差异表达基因
CNV,copy number variations; 基因拷贝数变异
ICPs,immune checkpoints. 免疫检查点
TIDE，The Tumor Immune Dysfunction and Exclusion
研究背景
胶质瘤相关基质细胞是新近发现的胶质瘤微环境中一种重要的基质细胞，具有预测预后和治疗前景的潜在价值。然而，胶质瘤微环境中GASCs的潜在机制在很大程度上仍然是未知的。有证据表明GASCs促进血管生成、侵袭和肿瘤生长。作者此项研究旨在探讨GASCs在胶质瘤中的作用机制，特别是在高级别胶质瘤（HGG）中的作用机制。
研究方法
本研究使用了来自TCGA和CGGA的胶质瘤数据集。下载了TCGA 702例、CGGA 693例胶质瘤样本的基因测序数据和临床信息数据，并进行甲基化分析。使用单样本基因集富集分析算法分别计算每个样本的GASCs富集分数，计算干细胞评分、间充质-上皮-巨噬细胞转变（EMT）评分、致瘤因子评分和血管生成活性评分、以及相应的基因组。接着，利用SsGSEA算法来区分GASC组高或低的患者。然后使用Morpheus鉴别高GASC组和低GASC组之间显著差异表达的基因，使用xCELL和CIBERSORT算法分析基质细胞和免疫细胞的组成，使用TIDE预测每个胶质瘤样本的免疫检查点抑制剂的临床反应。最后，构建风险评分和诺模图模型预测胶质瘤的预后。
研究结果
（1）、为了分析胶质瘤微环境中GASCs的潜在机制，作者分析了来自TCGA的702个样本和CGGA的693个样本的mRNA测序数据，然后使用ssGSEA算法计算每个样本的GASC得分。根据GASC评分的中位数将TCGA和CGGA的样本分别分为高GASC组和低GASC组（图 1），图1A、B显示了高GASC组和低GASC组的信息。另外，对来自TCGA的393个HGG样本和来自CGGA的504个高级别胶质瘤（HGG）样本也进行了单独的分类，将其分为高GASC组和低GASC组。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，在所有胶质瘤组和HGG中，GASC评分越高，OS越差(p<0.0001；图1C-F)。主成分分析结果显示高GASC组和低GASC组之间GASC标志物的表达图谱有显著差异(图1G-J)。
图 1 区分高GASC和低GASC群体。其中（A-B）表示所有神经胶质瘤人群中GASC标记物的热图；（C-F）代表所有神经胶质瘤人群和高级别神经胶质瘤人群的高GASC组和低GASC组样本的Kaplan-Meier生存（OS）曲线；（G-J）表示所有胶质瘤组和高级别胶质瘤的高、低GASC组的主成分分析结果（A、C、G、I代表TCGA，B、D、H、J代表CGGA）。
（2）、GASCs和基质细胞之间的关系
使用xCELL算法评估GASCs和其他基质细胞之间的关系，结果表示TCGA数据所有胶质瘤人群中高GASC组的内皮细胞、淋巴内皮细胞和微血管内皮细胞含量均较高，系数矩阵显示GASC评分和以上细胞水平呈正相关。单变量Cox回归结果也表明间充质干细胞是胶质瘤的保护因子（图 2）。
图 2 胶质瘤人群中GASCs和基质细胞之间的关系。（A、D）条形图显示高GASC组和低GASC组之间xCELL得分差异；（B、E）基质细胞单变量Cox回归分析森林图；（C、F）GASC评分与基质细胞相关性。（A、B、C为TCGA，D、E、F为CGGA）。备注:p>0.05,*P≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
（3）、高GASC组和低GASC组的免疫景观
使用CIBERSORT算法计算了22种免疫细胞的相对丰度，同时分析了GASCs与14个ICP的相关性。总的来说高GASC组相较于低GASC组，适应性免疫水平较低，但M2巨噬细胞水平在高GASC组中显著升高并和GASC评分呈正相关，并且是胶质瘤的危险因素。高GASC组大部分ICP表达水平有统计学差异，Cox回归结果显示，PD-L2、TIM3、CD80、CD86、CD155和CIITA表达水平是所有胶质瘤人群和HGG人群发生胶质瘤的危险因素，并且ICP内部存在很强的正相关，GASC评分也和它们存在正相关（图 3）
图 3（1）. 22种免疫细胞的相对丰度。（A来源于TCAG，B来源于CGGA）
图3（2）.GASC评分与免疫细胞、ICP表达之间的相关性。(A).所有胶质瘤人群的数据相关图；(B)高级别胶质瘤人群的数据相关图。
图 3（3）.GASCs与ICP表达的关系。（ACEG）柱状图说明了所有胶质瘤人群中高、低GASC组和高胶质瘤人群中表达ICP表达的差异；（BDFH）所有胶质瘤人群（B代表TCGA,D代表CGGA）和高级别胶质瘤人群（F代表TCGA，H代表CGGA）ICP表达的单变量Cox回归分析森林图。备注：p>0.05,*P≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
（4）、GASC评分与预后
生存分析结果表明，高GASC组DR3和CIITA的基因拷贝数变异显著升高，降低了胶质瘤患者的OS。而THY1和CD80甲基化水平升高有更好的生存期。
图 4. GASC标记物和ICP的甲基化分析。（A）盒子图显示了高GASC组、低GASC组和正常组中THY1、CD9、CD14、CD44、ITGAM和ACTA1甲基化水平的差异；(B).THY1、CD9、CD14、CD44、ITGAM和ACTA1甲基化高和低组样本的Kaplan-Meier总生存曲线；（C）.箱形图显示高、低GASC组和正常组中Galectin-9、CD80、CD155和LAG3甲基化水平的差异；（D）. Galectin-9、CD80、CD155和LAG3高甲基化组和低甲基化组样本的Kaplan-Meier 生存曲线。
（5）、免疫疗法应答的预测
应用TIDE工具预测每个样本的免疫应答可能性，结果表明，在所有胶质瘤患者中，低GASC组比高GASC组更有可能对免疫治疗有反应，在所有胶质瘤人群中，应答组的“T细胞CD8”和“巨噬细胞M0”水平较低，而“肥大细胞活化”较高，在HGG人群中则正好相反。（图 5）
图 5.高、低GASC组之间潜在的免疫治疗应答预测。（A）所有胶质瘤人群和高级别胶质瘤人群的潜在免疫治疗应答（A、C为TCGA，B、D为CGGA）；（E）GASC与预测免疫治疗应答的相关性；（F、I）条形图说明应答者和无应答者在所有胶质瘤人群和高级别胶质瘤人群中免疫细胞评分的差异。
（6）、风险评分体系的构建
最后构建了预测胶质瘤预后的诺模图模型，包括风险评分和临床病理特征。单因素和多因素Cox回归分析表明，GASC风险评分是胶质瘤预后的独立预测因素。
图 6.风险评分体系的构建和诺模图生存模型的建立与验证。（A-B）训练数据集的Cox回归分析；（C-D）为高风险和低风险组的Kaplan-Meier总生存曲线；（E）预后模型的单因素和多因素Cox回归分析；（F）预测1年、3年或5年生存率的诺模图；（G-H）诺模图预测1、3、5年生存率的时间相关ROC曲线；（I-J）IDH突变预测1、3、5年生存率随时间变化的ROC曲线。（C、G、I为训练数据集，D、H、J为验证数据集）
全文小结
作者首次观察到GASC与M2巨噬细胞和免疫检查点（PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、Galectin-9、CTLA-4、CD80、CD86、CD155和CIITA）水平呈正相关，并与所有胶质瘤组和HGG组的GASC评分呈正相关。GASCs通过M2巨噬细胞刺激胶质瘤恶性转化，并与胶质瘤微环境中免疫检查点的水平相关。高GASC组DR3和CIITA拷贝数变异较高，THY1甲基化降低，可作为胶质瘤的预后指标和治疗靶点。然而，GASCs在胶质瘤微环境，尤其是在HGG中的潜在机制，以及GASCs构建的风险评分作为胶质瘤预后的独立预测因子，还需要进一步的研究来证实。
（全文链接： https://doi.org/10.3389/fonc.2021.672928）
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