(eccDNA)circle-seq讲座视频学习

系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
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1、关于eccDNA

1.1 概念

• extrachromosomal circular DNA 染色体外环状DNA

• 指在真核生物中，指从正常基因组中分离或脱落下来（细胞核内），在染色体之外独立成环，以特殊的方式参与生理或病理过程。

  
  
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如上图左边是原核生物细菌示意图，也存在质粒环状DNA

• 下图为荧光观察示意图。以二号染色体为例，白色箭头即表示从2号染色体脱落下来的double minute双微小体(eccDNA的一种)

  
  
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1.2 分类

• from 50 base pairs to several mega-base pairs in length；
  即eccDNA长度分布范围很大
• Various types of eccDNA including small polydispersed DNA (spcDNA), telomeric cirlces, microDNA, etc. have been discovered.
• Among these eccDNA, extrachromosomal DNA (ecDNA), which encompasses the full spectrum of large, gene-containing extrachromosomal particles, has regained great research interest due to recent technological advances such as next-generation sequencing and super-resolution microscopy.
  ecDNA作为eccDNA的一种，长度相对较大。因而就有可能有更多的序列信息，是研究的热点。
  
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1.3 目前研究

（1）结构特点

• 染色体外，环型
• 可包含染色体多个位置的不同序列
• 可携带完整基因及其上有启动子、增强子元件
• 染色质开放性程度更高
• 活化性组蛋白修饰（H3K27ac等程度更高）

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（2）相关功能

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• 能提高癌基因、耐药基因等拷贝数和转录水平；
  前期研究表明肿瘤细胞有较多的eccDNA分布
• 随机分配到子细胞、驱动肿瘤的异质性

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• 介导DNA超远距离的相互作用
• .......

2、eccDNA研究方法

2.1 光学、荧光等技术

• 我认为主要是用于观察、验证eccDNA的存在与否

  
  
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• 实验中的一个细节就是捕捉处于有丝分裂中期metaphse阶段的细胞，用于观察
  因为此时为染色体 Chromosome状态， Chromosomes is rolled up DNA when it is going through cell division. Sister chromatids are the branches of the same chromosome.即染色体结构致密、凝集，ecDNA结构便于发现
  而非分裂期的染色质 Chromatin 状态则相对十分松散，难以观察到那些小DNA环

  
  
  image

2.2 测序分析

• 目前有两种路线，一种是进行全基因组测序WGS，从中筛选eccDNA结果；主要会用到AmpliconArchitect软件。不多做介绍，重点了解下第二种方法
  
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• 另一种则是直接提取制备circle DNA 文库，进行测序；即circle-seq

（1）上游实验流程

• 提取全基因组；
• 去除线性DNA（5-7d）
• 环状DNA扩增
• 建库测序

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（2）read比对

• 由于环状DNA的特殊性，read pairs情况有点复杂。需要记住的一点是eccDNA是由一段线性DNA环化而成，也就是说环上有一个连接点（circle conjunction）

  
  
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• 如上图，主要有三种read pairs
  regular read pair（方向相对）
  discordant read pair（完全跨junction，方向相反）
  split read（一端在junction）

• 对此，可用circle-map软件进行识别比对。原理见下图

  
  
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（3）后续分析

• read比对后，可注释环状DNA的序列功能区信息等等

  
  
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• 以上是一般都会做的标准流程分析，之后可根据自己的目的，联合多组学等方法进行深入探索。这些可以阅读相关文献，推荐如下。

1. Molecular Size and Circularity of DNA in Cells of Mammals and Higher Plants. Proc Natl Acad Sci US A, 1965
2. Extrachromosomal microDNAs and chromosomal microdeletions in normal tissues. Science, 2012
3. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science, 2014.
4. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature, 2017
5. New discoveries of extrachromosomal circles of DNA in normal and tumor cells. Trends Genet. 2018
6. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun, 2018
7. Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution. Nat Rev Cancer, 2019
8. Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications. Cell, 2019
9. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature, 2019