免疫组化实验原理(Vector kit)

    首先来谈一下免疫组织化学（IHC, Immunohistochemistry）、免疫细胞化学（ICC, Immunocytochemistry）和免疫荧光(IF, immunofluorescence technic)的共通之处和区别。

    平常说的免疫组化就是用石蜡切片做的免疫组织化学，样品是经过甲醇或甲醛固定后脱水包埋得到的组织切片。加入一抗二抗，经DAB底物显色，用普通的显微镜观察信号分布和强度。专业一点，免疫组化包括免疫组织化学和免疫细胞化学，即IHC和ICC。ICC与IHC的区别在于样品的不同，ICC的样品是细胞（提前制作的细胞爬片），并且常用荧光染色检测，也可以用酶联抗体显色，最后分别用荧光显微镜和普通光学显微镜观察和拍照。IF技术所用的样品范围广，可以用石蜡切片、冰冻切片，也可以用细胞爬片。而IHC多用石蜡切片，因为石蜡切片能保持完整的组织型态和蛋白表达位置，样本可大可小。冰冻切片由于不需要经过固定、脱水和修复等过程，蛋白的结构保持地更好一些，步骤也更简单快捷，是术中病理诊断的常用技术。用IF做ICC和冰冻切片的染色，过程类似。

石蜡切片和冰冻切片的比较

IHC、ICC和IF的原理有相似之处，本质上都是利用了抗原抗体的特异性结合。IHC和ICC中的“化学”，顾名思义，是通过化学反应显色。IF中的“荧光”是通过荧光基团被相应的激发光激发而发光，从而被检测到。不同之处在于，IHC和ICC是通过在二抗上偶联HRP（辣根过氧化物酶），以过氧化氢为底物，产生游离氧，后者使无色的供氢体DAB氧化为棕褐色沉淀定位于过氧化物酶所在部位。而IF则是在二抗上偶联荧光基团，在相应波长的激光激发下而发出荧光（是荧光染料的特性）。因此，前者用普通的光学显微镜即可观察到，而后者需要用荧光显微镜。可以根据自己的实验目的去选择不同的显微镜，如果只是简单的定位，要求可以低一些，如果需要做准确一点的定位和定量，需要更高分辨率的显微镜。

    我的课题做IHC和多标（mIHC）较多，故而，我会对IHC的讲解更加细致一些。

    肝脏组织固定收其中的两个中等大小的肝叶，用4%多聚甲醛的固定过夜（16~18h）。甲醛使组织中的蛋白交联，将组织形态固定住，同时使组织更致密且硬度增大。1xPBS洗三遍之后进行脱水，从75%EtOH开始，一般2~3h即可，如果当天来不及脱水（全程约10h），便可以在75%乙醇中过夜，甚至放一周也没问题。从75%-85%-95%-100%EtOH梯度脱水，是为了防止组织快速收缩，改变了组织形态，使得信号不容易被检测到。由于最后要用石蜡包埋，且组织内部和周边的石蜡最好达到均质的状态，才会利于切出完整的组织切片，而且100%乙醇与石蜡不互溶，二甲苯是石蜡的溶剂，所以不能直接通过乙醇直接浸入石蜡，而需要用二甲苯替换出组织中的无水乙醇，最后浸入石蜡中过夜，让石蜡充分进入组织。切片时选择5um的厚度，37℃展片和烘片。其实不必执着于时间，展片的标准应该是切片完全展开没有褶皱，并且石蜡不能融化，注意贴片时的手法，一般来说没有什么问题。烘片的目的是让组织与玻片完整贴合固定，并且烘干表面和周围的水，一般来说过夜后第二天收起来就可以了，四度保存。

    下面说一下IHC染色的问题。

    做过IHC的朋友都知道，这个实验很耗时间，一做就是两天，其中大部分时间都是零零散散，最重要的工作莫过于等待。个人认为做IHC的关键点在于：洗干净和二抗的孵育时间。如果洗不干净或者二抗孵育时间过长，肯定会造成非特异性染色，也就是背景，导致染色质量很差，甚至忙活几天都不能拿到具有分析价值的结果。我们做肝脏切片，用5%NGS（normal goat serum）封闭时间可以长一些（如果中间有事情），但最少一个小时。二抗的孵育时间是30min，AB complex（avidin+biotin）的孵育时间也是30min。由于二抗和avidin孵育时间长的情况下，会有非特异性染色，具体的原理，在后面介绍avidin+biotin的时候再细讲。我们实验室是固定DAB的显色时间是5min，根据信号强度来调整一抗的浓度。当然也可以摸DAB的显色时间，但个人觉得不太好把控。因为抗体的适合浓度是一个较大的范围，而DAB的显色时间很短。

    用单蒸水和1xTBST洗片子最好放在摇床上摇洗，会减少背景，亲测管用。再有一点就是画阻水圈，不要画太粗太细，更不要画地太靠近组织，否则滴加的极性试剂遇到油性阻水圈形成的液面会变高，导致组织边缘接触不到试剂而变干，从而有很高的背景。

    IHC整个过程除了洗，我们加的试剂有SP6000（vector）、5%NGS（goat）、Avidin、Biotin、一抗、二抗、A+B complex、DAB。下面说一下试剂的作用原理。SP6000是Vector公司出的试剂，用于封闭内源性的过氧化氢酶。由于二抗后面偶联的HRP就是一种过氧化氢酶，如果内源性过氧化氢酶太多，会造成非特异性着色。5%NGS是为了封闭内源蛋白，因为二抗对于一抗的识别是由于Fc片段，如果其他蛋白也有Fc片段同样会被识别，从而造成非特异性着色。在这里应该想到做western blot时用5%脱脂乳粉封闭，原因之一是为了将NC膜或PVDF膜上的未能结合蛋白的孔隙封闭住，防止二抗结合到孔内造成背景色，原因之二就是封闭其他的可能会与一抗结和的杂蛋白。血清的来源只要与一抗的来源不一样即可，goat和bovin都可以，因为一抗来源常见的无非是mouse或rabbit，选择一个通用的更便于实验。我们实验室做肝癌，肝脏细胞中有大量的内源性生物素（Biotin），由于二抗之后需要avidin-biotin-HRP的信号放大过程，前面需要加入外源的avidin封闭内源性的biotin（Avidin-Biotin高亲和）。由于Biotin是羧化酶的辅因子，Biotin会结合到酶的特殊位点上帮助酶发挥催化作用，再加入Biotin去封闭酶上的biotin的结合位点，在孵育AB complex的过程中才不会导致过量的biotin结合到酶的位点上，造成非特异性信号。WB的二抗上面直接偶联HRP，而IHC的二抗上面通过偶联Biotin的亚基，利用biotin和avidin的高亲和力来提高HRP的量，从而放大信号。二抗上面偶联HRP的量很少，而一抗结合二抗的数量有限。一个二抗结合一个biotin，一个biotin连接一个avidin，而一个avidin可以有四个基团连接biotin，于是达到了信号放大的目的。

    明确实验原理不等于能做好实验，个人认为实验习惯非常重要，不仅要心明眼亮，更要手稳，才能重复出来高质量的实验结果。

    后面会出一篇多标染色和一篇avidin-biotin的结合原理，敬请期待！