肿瘤单细胞的背景介绍

人体内的肿瘤是一个错综复杂的生态系统，它是由各种各样的细胞组成，包括恶性的，免疫性的，基质性的等各种亚类细胞群。传统的分析方法难以全面系统的分析肿瘤的生态体系，而单细胞测序技术作为一种强而有力的手段，能为我们精确到各种亚类细胞层面剖析肿瘤。

肿瘤内表达异质性能让肿瘤像器官一样支配着肿瘤的各种生物学功能，如肿瘤生长、转移和抗治疗。而肿瘤的异质性有三种决定因素。①在肿瘤进化过程中出现的亚克隆突变。②表观遗传学修饰调控基因的活性。③外来因素以及空间上的一些因素，这些因素可以改变癌细胞对营养物质的可及性，以及细胞之间的互作。单细胞测序技术整合了基因层面、表观遗传层面、以及肿瘤微环境层面，能够揭示癌细胞活性状态、行为以及对治疗的反应情况。

对肿瘤内细胞分群通常有两种办法，①通过特征基因判断细胞的类群，比如T细胞、纤维细胞等。②根据细胞分支的多元性，将其定义为不同的细胞状态，比如处于代谢状态的细胞，循环状态的细胞以及其他的一些动力学特征的细胞。通常，我们会根据每个亚群中优先表达的基因去注释细胞类型和状态。

通过目前单细胞技术的研究结果来看，恶性细胞的异质性比非恶性细胞强，且对于恶性细胞来说，瘤间异质性比瘤内的异质性高。

下面，根据单细胞癌症分析的新挑战和方向，简要描述了一些需要解决的主要问题，并指出促进这些研究的scRNA-seq领域的新兴技术。

（1）单细胞多组学分析以区分肿瘤的遗传性和非遗传性

遗传的异质性是产生肿瘤内以及肿瘤间的异质性的最可能的因素，但是目前有证据表明非遗传因素的机制的重要性。比如，IDH突变和H3-K27M突变的胶质瘤明显是非常依赖于遗传水平，因此，需要将细胞状态和遗传水平结合，并且发现对应的机制。

另外，治疗遗传性的与非遗传性的肿瘤内异质性的方案是相当不同的，到目前为止，大多数scRNA-seq研究忽略了细胞的遗传状态，也只有少数具有部分评估遗传状态的能力，主要通过

① 以有限的灵敏度检测RNA的突变 ；

② 个体突变的靶向扩增；

③ 推断CNAs（细胞拷贝数变异）。

但是这些技术都不是特别纯熟，还处于发展阶段，未来在改进之后或许可以对细胞状态和遗传水平进行联合分析。此外，多组学方法正在开发，从而将mRNA水平的测量与各种其他特征相结合，如蛋白质水平、DNA甲基化、染色质可及性、克隆扩增等。这些方法的出现对挖掘肿瘤内的异质性的机制有很大帮助，并可以将测序的准确性上升到更高的水平，同时为肿瘤研究提供了更多靶点。

（2）细胞间相互作用和空间定位:空间解析单细胞技术

每个肿瘤都类似于一个生态系统，因此，每个细胞的状态可能高度依赖于其确切的空间位置以及与相邻细胞的相互作用。这些复杂的相互作用及其对癌细胞生物学的影响尚未明确。转录组与空间信息的耦合将极大地提高预测和描述这种相互作用的能力，因此，许多与空间信息耦合的scRNA-seq方法正在开发。目前，10X genomic Visium空间基因表达解决方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）可以测量完整组织切片的总mRNA，将总mRNA的空间信息与形态学内容相结合，并获得所有基因表达发生的位置，绘制疾病复杂而完整的基因表达图谱。在确定不同细胞群的同时保留空间位置，为细胞功能、表型和组织微环境中位置的关系提供了重要信息。

空间组学三大特点：提供单细胞或者亚细胞组学的精确定位，为我们展示空间方向上的组织细胞异质性，同时将转录组信息和空间信息一一对应起来，解析器官发育空间上的蓝图，例如大脑和心脏。空间转录组方法分类：①结合算法技术和组学测序数据，重建空间构象。②结合激光捕获现为切割技术和二代测序技术结合，使用激光捕获感兴趣的区域再行测序，将分子信息和空间信息结合。但这种方法耗费大量人力物力，且精度不高。③基于图像的空间组学，基于单分子荧光原位杂交技术，缺点是必须是靶点型的，需要先知道目标，然后去设计。例如：In Situ Sequencing(ISS) 、MERFISH技术。④基于寡核苷酸的空间位点标识符NGS技术，例如：Spatial transcriptomics(ST)、HDST、Slide-seq。肿瘤图谱空间解析技术的持续改进，以及不同技术数据的整合，将在未来几年内显著地推动这些方向，并提高我们对细胞-细胞相互作用和空间效应的理解。

除了空间图谱，肿瘤细胞互作的研究也在持续性发酵，目前研究的焦点在细胞互作的受体和配体。通过受配体的数据库，将一群细胞中的受体基因和另外一群细胞的配体基因耦合起来，由于肿瘤微环境的复杂性，这种潜在相互作用的数量是巨大的，需要后续研究来确定个体相互作用的意义。

（3）疾病复发可以利用冻样去进行细胞核分析

在许多的癌症治疗过程中，预后不良的情况一般对应着更严重的肿瘤复发，而且复发的肿瘤具备更强的侵袭和耐药能力，这凸显了对复发肿瘤生长研究的必要性。目前大部分研究比较原位肿瘤和复发肿瘤的相关研究揭示了各种耐药的机制，未来即将利用scRNA-seq更加详细地探究原发瘤和继发瘤之间的差异，但是难以应对的挑战是两种瘤都需要新鲜的样本，所幸，目前有单核RNA测序的方法可以对保存下来的冻样进行测序，这克服了解离偏倚的问题，也使得原发瘤和继发瘤之间的对比更为精准。

（4）肿瘤亚群:它们的检测、功能意义和起源

肿瘤的发展是一个进化的过程，因此，只有少数细胞能够通过选择逐渐形成新的表型。因此，关键的亚群，如癌症干细胞、耐药细胞和转移细胞，可能反映了一个非常罕见的亚群(例如，细胞比例小于0.1%)，大多数方法都无法检测到，包括当前的scRNA-seq方法。一旦发现了独特的亚群，它们的功能和临床意义仍然难以确定。有两种主要的方法可以进一步分析这些亚群，大批量研究将揭示亚群的存在与临床特征(如生存、转移和药物反应) ：①考虑到与大批量的scRNA-seq相关的成本和人工，我们将利用现有的大组RNA-seq数据集，并使用计算方法进行反卷积推断肿瘤成分。然而，无论这些研究是基于单细胞还是整体RNA-seq谱，这些相关研究都需要机制上的跟进。②第二种方法将依赖于通过scRNA-seq找出这些亚群的marker genes，利用marker gene做标记，分离这些亚群，再在动物或者培养模型上做进一步的功能分析。③恶性细胞和正常细胞之间的相关性。最近的scRNA-seq揭示了在肿瘤表达谱和正常发育细胞类型的显著的相似性，提出关于癌症的起源和发生在癌症内部的分化过程的具体假设。研究通过计算广泛的肿瘤和正常组织的发育过程，改进以前的相关结论。例如：Filbin等(Filbin et al., 2018)人的文献中，利用scRNA-seq技术高度强调了恶性细胞和与少突胶质前体细胞的相似性，有力地论证了之前的文章证明“恶性肿瘤细胞是起源于少突胶质前体细胞”的观点(Gibsonet al., 2018)。这些推论需要注意的是，已建立肿瘤的scRNA-seq不能识别最先发生突变的细胞(突变细胞)，此外，恶性细胞和正常细胞之间的比较不仅突出了相似性，而且还提供了肿瘤细胞和它们的假定来源细胞之间的差异的更详细的视图，从而增加我们对致癌过程的理解。

（6）独特的肿瘤表型和特殊反应样本的单细胞分析

尽管治疗决定是基于多样本的统计模式，但是异常值依然是相当普遍的，这类病例的独特表型一直难以研究，主要通过大量遗传分析。然而，scRNA-seq以及上述相关技术的改进(如空间图谱和多组学技术)，使肿瘤生态系统的表征达到了前所未有的深度和广度。所以，这是我们研究极端表型的基础，而且极端表型在肿瘤发生发展过程中往往发现得较晚，所以我们也可以依赖于已存档的冷冻样品的分析，单细胞核测序技术（snRNA-seq）为其提供了便捷的分析方法。