血液微生物RNA提取注意事项

操作步骤 （ 请自行准备无水乙醇、异丙醇和 1.5mL 灭菌 RNase-free 离心管 ）

1. 取出洗涤液，按以下操作：

a) 洗涤液 A：按终浓度 30%比例加入无水乙醇，如 7mL 加入 3mL 无水乙醇；21mL 加入 9mL 无水乙醇，充分混匀。

b) 洗涤液 B：按终浓度 70%比例加入无水乙醇，如 3mL 加入 7mL 无水乙醇；9mL 加入 21mL 无水乙醇，充分混匀。

2. 取 1.5mLRNase-free 灭菌离心管，加入 200μL 血液样本，再加入 180μL 裂解液、3μL 消化液 A 和 20μL 消化液 B，振荡混匀，65℃水浴10 分钟。

3. 加入 400μL 异丙醇，混合均匀，如有半透明悬浮物，不影响 RNA 的提取与后续实验。

4. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液；

5. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内，静置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

6. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，静置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

7. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

8. 按每份样本 40μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 400μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。

9. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。

10. 取出吸附柱，放入新的 1.5mL RNase-free 灭菌离心管内，在吸附柱中心加入 40 μL 预热洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 RNA 溶液。提取的 RNA 即可用于下一步实验或-70℃保存。

注意事项：

1.裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。洗涤液加入乙醇后要充分混匀，最好现用现配，每次根据所要提取的样本量计算后适量配制。

2.如血液量不足200μL，请用0.85% 生理盐水补至200μL；如需血液量超出200μL，请使用BIOG中大量血液RNA提取试剂。

3.如果提取的血液为鸟类、禽类的血液，因有核红细胞较多，提取血液量应适当减少，研究者应先进行优化实验，选择合适用量。

4.为防 RNA 酶污染，实验过程中最好戴一次性干净手套、口罩，使用处理过的无 RNA 酶的容器和无 RNA 酶的超纯水。

5.提取的 RNA 如暂不使用，应-70℃保存，可适当加入 RNA 保护因子（货号：51090，一般 40μLRNA 溶液加入 2μL）。