项目文章丨单细胞多组学联合揭示神经元发育的进化调控网络

2022年3月，来自中科院遗传发育所许执恒团队和吴青峰教授在 Cell Research 杂志上合作发表了题名为“Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing”的研究论文，该研究利用单细胞 scRNA-seq 和单细胞 scATAC-seq 对人类及食蟹猕猴神经节隆起（Ganglionic eminence，GE）的基因表达特征进行了描述，揭示了在胚胎发育早期神经节隆起的细胞多样性以及发育轨迹，通过与小鼠的跨物种比较，首次确定了灵长类神经节隆起中外侧放射状胶质细胞（outer radial glia cell，oRG）的存在，最终利用单细胞 scATAC-seq 建立的人类神经节隆起发育的调控网络，找到了人类特异的基因及其相关的新调控途径。该研究为大脑神经节隆起发育调节及相关疾病的分子机制研究提供了线索。该研究中单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。

【发表期刊】Cell Research

【发布时间】2022年3月

【影响因子】25.61

【关键词】单细胞转录组，单细胞ATAC，神经发育

科学问题

人脑复杂有序的神经网络主要由兴奋性神经元和抑制性中间神经元组成。中间神经元是一种高度多样化的神经元，具有不同形态、连接性和生物学功能的特点。兴奋/抑制平衡障碍与许多神经发育和神经精神障碍有关，中间神经元几乎全部来源于神经节隆起（Ganglioniceminence，GE），GE 可分为三个亚区，包括外侧神经节隆起（Lateral ganglionic eminence，LGE）、内侧神经节隆起（Medial ganglionic eminence，MGE）和尾侧神经节隆起（Caudal ganglionic eminence，CGE），每个区域表达特定的基因，并产生了时间和空间上不同的中间神经元，有助于区域细胞多样性和中间神经元迁移。

在小鼠单细胞的研究已揭示了在胚胎发育过程中 GE 中间神经元转录特性的多样性。然而，关于灵长类动物 GE 发育过程中抑制性神经元产生的研究报道很少，由于之前研究对转录谱分析的缺乏或质量不高，对啮齿动物和灵长类动物之间的保守性和异质性的研究仍然有限。此外，中间神经元在发育历程中的复杂调控网络、细胞增殖、空间区分、谱系分化和神经元迁移等机制仍然不清楚。

技术路线

研究技术路线

主要研究结果

1、灵长类细胞早期发育阶段的细胞多样性

研究者选用胚胎发育早期的食蟹猕猴（孕周为 7、10、12 周）和人类胎儿样本（孕周为 9、13 周），进行单细胞多组学检测（scRNA、scATAC），然后混合物种进行整合分析，得到细胞类型分群图（图1 A-D）。随后文章分析了不同物种的细胞比例以及细胞类型的基因表达相似性，结果都表明人类和猕猴的 GE 细胞在细胞类型上没有显著差异（图1 E、F）。随后的轨迹推断，则表明由 GE 祖细胞（GE progenitor）起源，并增殖生成 IPC 细胞（中间祖细胞，Intermediate progenitor），然后在 MGE、LGE 和 CGE 中分化成不同的谱系（图1 G）。

综上所述，结果证实了猕猴与人类 GE 的基本保守性，揭示了人类与猕猴细胞的多样性和发育轨迹。

图1 灵长类 GE 转录谱特征

2、灵长类 GE 祖细胞的细胞特性

随后文章提取神经祖细胞亚群，进行重新聚类分析，鉴定出 RGC（Radial glia cell）和 IPC（Intermediate progenitors）（图2 A-B）。随后在 RGC 重聚类结果中，观察到不同区域的祖细胞特性，NKX2-1、PAX6 和 NR2F2 分别代表 MGE、LGE 和 CGE 祖细胞（图2 C）。

外侧放射状胶质细胞（Outer radial gliacells, oRGs）先前被证明是灵长类脑容量扩张的关键因素。单细胞数据发现 oRGs 特定表达 HOPX 基因，随后利用免疫荧光发现在人、猕猴GE的脑室区 VZ、脑室下区 SVZ 都呈现HOPX 阳性,然而，在小鼠中却未观察到（图2 D）。这说明 oRGs 存在于灵长类动物的大脑发育过程中的神经节隆起。

然后，研究者试图找出灵长类和小鼠之间 GE 祖细胞的差异。将三者数据整合在一起，建立祖细胞分群。针对 HES1+ 的RGC，进行了不同物种间基因表达差异分析，证实了小鼠与灵长类动物的 RGC 差异（图2 E）。针对 IPC 细胞的分析表明，RGS16 在刚进入有丝分裂后期的灵长类和小鼠细胞中均有特异性表达（图2 F），而 scATAC-seq 的基因调控网络显示，RGS16 受 PAX6、GLI3、HES5 等增殖相关基因调控（图2 F）。这些结果暗示 RGS16 可能作为 IPC 和细胞命运决定前体之间的过渡因子。

上述结果表明，灵长类动物在发育中的 GE 和大脑皮层中都存在 oRG，可能是灵长类动物和啮齿类动物物种差异的原因之一。

图2 灵长类 GE 祖细胞的表征及不同物种的比较

3、发育过程中 MGE 的细胞命运

为了描述 MGE 的发育谱系，对 MGE 细胞进行重分群和轨迹重建，最终鉴定出四种不同的细胞类型，所有较成熟的细胞均有细胞粘附和轴突投射有关的基因表达（图3 A-D）。

SST+ 中间神经元中，发现涉及迁移的基因表达，提示 MGE 的 SST+ 中间神经元会向大脑皮层迁移（图3 B）。LHX8+ 细胞在早期样本的 MGE 中检测到，但在较后期的样本中没有检出，表明 LHX8+ 胆碱能投射神经元可能在灵长类大脑发育早期产生，与小鼠的研究结果一致（图3 F）。

还有两群特异表达的细胞，特征图显示，ANGPT2+ 细胞与 LHX8+ 细胞完全分离，而 CRABP1+ 在一小部分 LHX8+ 细胞中表达（图3 E），进一步的差异基因分析则发现，这些细胞表达皮层PV（parvalbumin）中间神经元前体的标志基因，因此，研究者假设这些细胞在大脑发育过程中会向大脑皮层迁移，代表皮层 PV 中间神经元的前体。

综上结果，MGE 中细胞的分化较早，细胞系的多样化具有时间依赖性，这也体现在 Monocle3 构建的拟时序结果中（图3 G-H）。

图3 灵长类 MGE 发育的分析

4、发育中 LGE 的细胞命运决定

LGE 被认为是纹状体中间神经元和嗅球（olfactory bulb，OB）中间神经元的起源。因此对 LGE 谱系进行重聚类，鉴定了细胞类型（图4 A-B）。随后 OB 谱系的差异分析结果显示 OB 谱系高表达干细胞相关基因，而 GO 功能分析也发现了 OB 中间神经元前体存在于 LGE 的证据（图4 C-D）。而不同时间点的细胞分布则表明，OB 谱系细胞主要在晚期检出，表明 LGE 中的 OB 中间神经元前体晚于纹状体前体的产生，然后迁移到嗅球进行进一步增殖。

文章发现一组特异细胞，共享 MGE 标记以及 LGE 标记物，且与典型的 LGE 的纹状体细胞不同（图4 E），CellChat 分析发现 SEMA3 信号通路在 LGE 组中高度激活（图4 F），这些特异细胞表达 NRP1 做出反应，文章假设该组细胞可能来源于 MGE，并在 SEMA3 信号通路的调控下沿发育纹状体向皮层迁移。其它高表达基因 PEG10 可以产生长链非编码 RNA 和 PEG10 蛋白，先前的研究表明，它能促进癌细胞的迁移，且 MIR7-3HG 作为竞争性内源性 RNA，从其它 miRNA 中释放 PEG10，而 MIR7-3HG 也在这些细胞中也是高表达，可能调节 PEG10 的表达。

这些结果表明，在 GE 发育过程中，一组来自 MGE 的 LHX8+ 中间神经元沿着 LGE 迁移，并受到 SEMA3A-NRP1 信号通路和 MIR7-3HG-PEG10 通路的调控，结合拟时序分析，文章构建了 LGE 区域的遗传调控模型（图4 G-H）。

图4 LGE 的发育和迁移细胞的可能特征

5、人类 GE 的转录调控网络

文章还对 GW9 人类样本进行了 scATAC-seq，基于单细胞数据，对 scATAC 进行细胞类型注释，并使用基因表达预测工具，预测了其典型标记基因的表达水平（图5 A-B）。ZNF503 和 LHX8 是 LGE 和 MGE 谱系的代表性标记，scATAC 结果发现，它们上游都存在染色质开放峰，这些发现提示标记基因在 MGE、LGE 中表达的可能调控机制（图5 C）。随后文章基于多组学数据整合，生成的基因调控网络，以确定候选转录因子和调控因子，PPI 分析也得到类似的结果（图5 D-E）。

接下来，文章试图寻找可能在 GE 发育过程中发挥重要作用的未知基因，结果发现，miRNA9-1 宿主基因 MIR9-1 HG 脱颖而出，它在GE祖细胞和 MGE 中表达较高（图5D），结合染色质开放峰和 TFs 的潜在结合序列，筛选出了一些可能的调控 TFs。基因表达的相关分析提示，MIR9-1HG 的表达受 TCF4 的正向调控（图5 G）。转录因子 ASCL1 位于 MIR9-1HG 下游，与 MIR9-1HG 在祖细胞中呈显著负相关，而在 MGE 和 LGE 中呈正相关(图5 H-G）。

进一步检测了 MIR9-1HG 潜在的下游基因。从不同的数据库中搜索了 hsa-mir-9-1 的靶基因，所有数据库中均发现有4个基因同时受到 hsa-mir-9-1-3p 和 5p 的调控。其中两个是 LGE 特异性 TF，ZFHX4 和 ID4，这两个基因在 MGE 和 LGE 中的表达水平与 MIR9-1HG 呈显著负相关（图5 G）。

综上，这些结果提出了 MIR9-1HG 受 ASCL1 和 TCF4 调控的新途径。hsa-mir-9-1 可以抑制 ZFHX4 和 ID4 的表达，这可能解释了在人类早期大脑发育过程中，MGE 和 LGE 的不同命运是如何决定的。

图5 scATAC-seq 分析 MGE 与 LGE 的异质性调控

总结

与啮齿类动物相比，尚未揭示人类 GE 中的基因调控网络或独特的发育机制，因此文章通过 scRNA-seq、scATAC-seq 等技术，研究了灵长类胚胎中神经节隆起的单细胞转录特性，以及在不同亚区决定的细胞命运的可能基因调控网络，以及细胞迁移等。在神经发育阶段，文章研究了人类和猕猴 MGE、LGE 和 CGE 的早期细胞分化和迁移，而人类和猕猴数据集之间的整合则揭示了高度保守的 GE 细胞多样性，灵长类 GE 中存在 oRG，以及人类 LGE 中一条新的调节途径，发现了对人类GE 区域的细胞命运决定具有潜在重要性的 TF，以及它们的基因调控网络，包括可能导致 MGE 和 LGE 不同命运的新调控途径。

参考文献：

ZHAO, Ziqi, et al. Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Research, 2022,1-12.