-3.仅作笔记使用
我所用到的所有脚本可以+Q 840842906索
简单介绍一下方向也可以，说不定以后能互相帮忙～
注明来意，请实名 学校+名字
-2.两组样品，目的是通过宏基因组找到两组间的差异以及差异的成因
-1.原理
略
0. Megahit/SPAdes组装
略
1.基因预测
1.1 软件安装 - metagenemark/prodigal
略
参考：https://www.jianshu.com/p/b8d0cd39bb67 --- genemark
http://wap.sciencenet.cn/blog-2379401-1085480.html --- https://github.com/hyattpd/Prodigal
1.2
genemark参考：https://www.sohu.com/a/207036304_99908466
for i in {B2A,B3A......} (下面会省略，$i的意思即中括号内的内容)
do
prodigal -a $i/$i.pro.fa -d $i/$i.gene.fa -f gff -g 11 -i $i/$i.fasta -p meta -s $i/$i.stat_Potential.gene -m -q
done
-i是输入文件即组装好的contig，这里不同的文章会过滤掉不同长度的contig，过滤掉不同长度的预测结果的CDS，可以自行查阅文献
我这里以两篇学位论文为例： (当然我没有混组装，我是每个样本组装一次，预测一次, 然后把所有样本的预测结果cat到一起
1.3 然后需要给预测的基因重命名，过滤长度(
(以下步骤有错误, 请忽略)
(1)sed '/>/s/gene/B2A_gene/' $i/$i.gene.fa | sed '/>/s/|GeneMark.hmm//' | awk '{print $1}' > $i/$i.gene.fa2
(2)awk -F "|" '{print $1}' $i/$i.gene.fa2 > $i/$i.gene.fa3
(3)bioawk -c fastx '{print $name, length($seq)}' $i/$i.gene.fa3 > $i/$i.length
(4)awk '{if ($2 > 99) print $1}' $i/$i.length > $i/$i.keep
(5)samtools faidx $i/$i.gene.fa3 -r $i/$i.keep > $i/$i.filter.gene.fa
(6)rm $i/$i.gene.fa2;rm $i/$i.gene.fa3;rm $i/$i.gene.fa3.fai;rm $i/$i.keep;rm $i/$i.length
(1)和(2)是重命名，把每个基因命名为 B2A_gene_1、B2A_gene_2......
(3)是获取每个基因的长度 (4)是得到长度大于100的基因名 (5)是用samtools提取前面长度大于100的基因名 (6)是清楚中间文件
比较丑陋，见谅
(以上步骤有错误, 请忽略)
在过滤prodigal的时候猛然发现bbmap有现成的工具：
(其实是在运行atlas的时候翻看atlas的命令行发现的，atlas是一个宏基因组分析的snakemake流程：https://github.com/metagenome-atlas/atlas)
java -ea -Xmx34677m -Xms34677m -cp /data/01/user164/software/bbmap/current/ jgi.RenameReads in=test.fa out=out.fa ow=t prefix=X minscaf=100 ignorejunk
prefix=$i.gene就是把基因重命名为 B2A.gene.1 B2A.gene.2 。。。。。。
minscaf=100即过滤掉长度小于100 in=即输入文件 out=即输出文件
1.4 把所有样品，重命名/长度过滤后的gene.fa cat到一起
2.CD-Hit去冗余
cd-hit -i input.fa -o out.fa -c 0.95 -d 0 -aL 0.9 -uL 0.05 -aS 0.9 -T 80 -M 15000
用了-T 80，上了学校的超算, 一下午完事；；之前用的-T 14，在集群上很慢要一个周
参数的解释https://www.sohu.com/a/207036304_99908466, 个人感觉参数可以跟着上面照抄
3.相对丰度的计算和长度标准化
3.1 ref : https://www.jianshu.com/p/a28c1729168e?ivk_sa=1024320u 这个链接里面相对丰度的计算是用的SOAP，但是我没有找到SOAP相关的任何信息，所以用的bwa mem，包括还有Salmon、bowtie2+bbmap也可以做相同的东西
bwa mem -p 去完冗余的结果 样品1.1.fq.gz 样品1.2.fq.gz > 样品1.sam
得到 每个基因在样品1上的比对情况
3.2
grep -v ^@ $i.aln.sam | cut -f 3 | sort | uniq-c | awk ‘BEGIN{ FS=“ ”;OFS=“,” }{print $2,$1}’ | awk ‘BEGIN{ FS=“,”;OFS=“,”}{ if ($2 > 2) print $1,$2;else print $1,“0”}’ > $i.count.csv #获取到每个gene比对到的reads数量,比对数小于等于2的直接标0, 接着进行长度标准化
3.3 ref : https://www.jianshu.com/p/a28c1729168e?ivk_sa=1024320u 这个链接里面相对丰度的计算是用的SOAP，但是我没有找到SOAP相关的任何信息，所以用的bwa mem
然后还需要获取非冗余基因集(即CDHIT的结果)每个gene的长度：
bioawk -c fastx ‘{print $name, length($seq)}‘ 去冗余的结果 | tr “\t” “,” > gene.length.csv 第一列是基因名/序列名，第二列是该序列长度
然后获取gene.count.csv中每个gene的长度
大体上就是用gene.count.csv的第一列和gene.length,csv的第一列匹配，匹配得上，就输出gene.count.csv的每一列(基因名，count)和gene.length,csv的第二列(基因长度)
如果匹配不上，就输出gene.count.csv的第一列, 该基因的count为0，长度
python jiyinfengdu.py $i.count.csv $i > $i.tmp
现在再根据上面那个标准化的公式来算就很简单了，很多方法都能实现
3.4：再将每个样本的数据合到一块即可
paste B2A.tmp B3A.tmp B4A.tmp > end.tsv
后续就可以进行可视化、功能注释等
待续
用到的脚本
2022.4更新
关于基因相对丰度的计算，又发现了一些其他的方法 (宏基因组的定量还没有一个很好很权威的方法
本文所用方法已经是12年的了(虽然才看到几篇文章还在用)
1.MOCAT2 (16年发在Bioinformatics)
好就好在方便很多，组装预测丰度一条龙全包了
2.Wen, C., Zheng, Z., Shao, T., Liu, L., Xie, Z., Le Chatelier, E., ... & Li, H. (2017). Quantitative metagenomics reveals unique gut microbiome biomarkers in ankylosing spondylitis. Genome biology
这篇发的好一点，也给出了一个方法