10X单细胞空间联合分析远端肺图谱

作者，追风少年i~

hello，周三了，时间很快，夏至已过，今年差不多过半，距离30岁的自己，也越来越近了，现在的自己想对30岁的自己说一句话，无论遇到什么，希望都可以坦然面对。

今天我们继续单细胞空间联合分析，多积累积累经验，文章在Human distal lung maps and lineage hierarchies reveal a bipotent progenitor,2022年4月发表于nature，非常好的文章，好的文章通常都有新的发现，而且空间转录组实验类的文章大部分老外在发，国内仍然乏善可陈，可见对于新技术的接受度，国外更好一点。

使用空间转录组学和微解剖远端气道的单细胞分析，确定了分子上不同的末端和呼吸细支气管 (TRB)细胞类型，这些细胞类型以前没有被表征过。这些包括气道相关的 LGR5+ 成纤维细胞和 TRB 特异性肺泡 0 型 (AT0) 细胞和 TRB 分泌细胞 (TRB-SCs)。连接组图和基于类器官的共培养表明 LGR5+ 成纤维细胞在气道生态位中形成了一个信号枢纽。AT0 细胞和 TRB-SCs 在灵长类动物中是保守的，并在人类肺发育过程中动态出现。

使用非人类灵长类动物肺损伤模型，连同人类类器官和组织标本，表明再生肺中的肺泡 2 型细胞瞬时获得 AT0 状态，它们可以从中分化成肺泡 1 型细胞或 TRB- SC。这种分化程序不同于在小鼠肺中确定的分化程序。研究还揭示了驱动双能 AT0 细胞状态分化为正常或病理状态的机制。总之，研究结果修正了人类肺细胞图谱和谱系轨迹，并暗示了灵长类动物肺再生和疾病中的上皮过渡状态。

好了，今天我们就要解析一下这篇文章的研究

绘制组成细胞的空间分布和分子特征对于了解健康和疾病中的组织动力学至关重要。目前的研究缺乏人类远端气道的综合图谱，包括与呼吸系统疾病有关的终末细支气管和呼吸道细支气管 (TRB)。在这里，使用空间转录组学和微解剖远端气道的单细胞分析，我们确定了分子上不同的 TRB 细胞类型，目前而言，这些细胞类型以前没有被表征过。这些包括气道相关的 LGR5+ 成纤维细胞和 TRB 特异性肺泡 0 型 (AT0) 细胞和 TRB 分泌细胞 (TRB-SCs)。连接图谱和基于类器官的共培养表明 LGR5+ 成纤维细胞在气道生态位中形成了一个信号枢纽。 AT0 细胞和 TRB-SCs 在灵长类动物中是保守的，并在人类肺发育过程中动态出现。使用非人类灵长类动物肺损伤模型，连同人类类器官和组织标本，表明再生肺中的肺泡 2 型细胞瞬时获得 AT0 状态，它们可以从中分化成肺泡 1 型细胞或 TRB- SC。这种分化程序与在小鼠肺中发现的不同。研究还揭示了驱动双能 AT0 细胞状态分化为正常或病理状态的机制。总之，研究结果修正了人类肺细胞图谱和谱系轨迹，并暗示了灵长类动物肺再生和疾病中的上皮过渡状态。

Introduction

人类疾病通常伴有异位或异常细胞类型或细胞状态。以单细胞分辨率进行细胞分析的技术进步能够全面绘制复杂组织中的大量细胞及其分子特征。到目前为止，大多数肺细胞绘图研究都依赖于从支气管中收集的活检样本或细胞的解离，这并不代表整个肺并且缺乏详细的空间分辨率。人类 TRB 的细胞组成仍然难以捉摸。 TRB 位于气道和肺泡之间的交界处，构成一个过渡区，被认为与许多呼吸系统疾病密切相关，包括特发性肺纤维化 (IPF) 和慢性阻塞性肺病 (COPD)。由于 TRB 的长度（小于 2 毫米）和直径（小于 1 毫米）都非常小，因此很难捕获这些区域中存在的细胞，这些区域在解剖学上与小鼠肺中的连接区域截然不同。

Result

Molecular survey of human distal lung

为了建立分子和空间定义的人体气道细胞图，采用了两种平行的方法。 首先，使用 Visium 技术对肺切片进行了空间转录组 (ST) 分析。 具有叶支气管的切片上的 ST 点的无监督聚类产生九个clusters，包括上皮、间充质、平滑肌、软骨、内皮和神经元谱系。 分析发现上皮cluster 3、5 和 7 分别对应于气道黏膜下腺、管腔和基底上皮。 同样，远端肺切片上的 ST spot显示 7 个clusters，表达气道和肺泡上皮、间充质、平滑肌和内皮谱系特征的标志物（这块儿对空间的直接注释细胞类型的方法需要重点看一看）。

其次，从周围组织显微解剖远端气道（直径小于 1 毫米，与肺泡相邻）。 解离后，进行单细胞转录组分析。 整合来自三个供体的数据，并使用均匀流形近似和投影 (UMAP) 进行降维。 从内皮、免疫、上皮和间充质谱系中鉴定出约 21,700 个细胞聚集成 45 个clusters。 大多数已知的内皮细胞（动脉、静脉、淋巴管、支气管血管、气细胞和“normal”毛细血管 (gCap)）和免疫系统（经典和非经典单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、血浆、嗜碱性粒细胞、B、CD4+ 和 CD8+ T 、NK 和树突状）和间充质细胞类型被捕获。

Schematic representation of experimental workflow for spatial transcriptomics (ST) (top left) and distal airway dissection, dissociation and capture for scRNA-seq (bottom left). In situ (left) and UMAP visualization of ST spot clusters obtained from the proximal airways and distal lung (top right). Bottom right, UMAP visualization of major cell classes profiled by scRNA-seq. Scale bars, 5 mm (far left bottom image); 1 mm (right bottom image).

Spatial transcriptomics of cartilaginous airway and distal lung. a. Heat map shows differentially expressed genes in each cluster of ST assay from proximal airway. b. ST spots show expression of indicated genes from proximal airway. c. Heat map indicates differentially expressed genes in each cluster of ST assay from the distal lung. d. ST spots indicate the expression of indicated genes from the distal lung.

a. UMAPs show the expression of cell class specific marker genes. b. Dot plot indicates expression of cell type specific markers. c. UMAP shows the annotation of cell types from blood (c), endothelial (d), and mesenchymal (e) lineages.

分析确定了 18 个不同的上皮细胞clusters，这些细胞clusters根据 SFTPB 表达的存在与否分为两个不同的populations。将这些称为 SFTPB- 和 SFTPB+ populations（为什么选择SFTPB这个基因，需要研究一下，可能与实验经验，病理学认识有关）。 MUC5AC、MSLN 和 MUC13 的转录本在 SFTPB- population中富集，而 SFTPB、SFTPA1、SFTPA2、SCGB3A2、RNASE1 和 NAPSA 在 SFTPB+ population中富集。这些基因的表达模式与上述 ST 数据的直接比较以及对单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和 ST 数据的综合分析表明，SFTPB- population标志物与近端气道相关，而 SFTPB+ population的存在于远端气道。 RNASE1、MUC5B 和 SFTPB 的荧光原位杂交 (FISH) 进一步验证了这些发现。肺切片上 SCGB3A2、SCGB1A1、MUC5AC、MUC5B 和 SFTPB 的免疫染色和定量证实 SFTPB+ 群体标志物仅存在于远端细支气管中。此外，SFTPB- 和 SFTPB+ populations标记的表达模式将气道分为四个组织学上不同的区域。以前研究的健康人肺 scRNA-seq 数据中不存在一些属于 SFTPB+ populations并位于 TRB 中的细胞类型。总之，这些数据确定了区域特异性标志物和细胞类型，目前而言，这些标志物和细胞类型以前在人类气道中没有被表征过。

b, Dot plot showing distal and proximal airway cell-specific markers. c, UMAP indicating the annotation of epithelial cell types

f. H&E reference sections and ST spots show the expression of RNASE1 in proximal (top) and distal airway (bottom). g. ST spots show the expression of MUC5AC, SFTPB, MUC5B and SCGB3A2 in proximal and distal airways as indicated. h. PLISH for RNASE1 (grey), MUC5B (green) and SFTPB (red) in proximal (top) and distal airways (bottom). blue (DAPI) indicates nuclei. Scale bar: 50 μm. i. Visualization of indicated epithelial cell transcriptomic signatures on ST tissue section from distal lung

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Unique distal airway epithelial cells

发现了共同表达 SFTPB 但在 SCGB1A1、FOXJ1、SCGB3A2 和 SFTPC 的表达上不同的上皮细胞类型（这个地方也很特别，这些基因是如何选择出来的？？）。进一步的分析表明，这些细胞类型中的每一种都显示出远端气道内的特定定位模式。首先，表达 SFTPB 和 SCGB3A2 但缺乏 SCGB1A1、FOXJ1 和 SFTPC 的population是 TRB 特有的，称它们为 TRB 分泌细胞 (TRB-SC)（空间定位的分析还是相当重要）。其次，SFTPB+S CGB3A2+SCGB1A1+ 细胞位于末端细支气管近端的远端气道，因此将这些细胞称为末端细支气管前分泌细胞（pre-TB-SCs）。它们缺乏 MUC5AC 和 MUC5B，它们的空间定位是特定于前结核病的，需要新的命名法。 PEG10、MS4A15、NAPSA 和 H19 的表达，或 SPARCL1 和 TMEM45A 等的缺乏表达，将 TRB-SCs 与 pre-TB-SCs 区分开来。 TRB-SCs 和 pre-TB-SCs 共享许多已知调节体液平衡（CFTR、SCNN1G 和 SCNN1B）和 VEGFR 信号传导 (KDR) 的蛋白质的常见转录本。通路富集分析表明，TRB-SCs 表现出免疫调节功能，例如炎症反应、肿瘤坏死因子 (TNF) 信号传导和抗原加工和呈递。

Schematic representation of human distal airways

Immunostaining for ACTA2 (green), SFTPB (red) and SCGB3A2 (grey) (top and middle); and SCGB3A2 (green) and SFTPC (red) (bottom). Top image, terminal bronchiole; bottom two images, respiratory bronchioles. Yellow arrows (middle) and white arrows (bottom) indicate SFTPB+SCGB3A2+ and AT0s, respectively. Scale bars, 20 μm. Top and middle, maximum intensity projections of z-stacks.

g. UMAP plots show the expression of indicated genes in epithelial cells. h. UMAP plots show the expression of indicated genes in epithelial cells. i. (top) Immunostaining for SCGB3A2 (green), SCGB1A1 (grey) and NAPSA (red) showing the expression of NAPSA in TRB-SC and TB-SC. Scale bar: 10 and 20 μm. (bottom) RNA-FISH for SCGB3A2 (green), TMEM45A (red) and SCGB1A1 (grey) showing the expression of TMEM45A in TRB-SC and TB-SC. blue (DAPI) indicates nuclei. Scale bar: 20 μm. j. PLISH for SCGB3A2 (green), SFTPB (red) and KDR (grey). Scale bar 50 μm. k. UMAPs show the expression of indicated genes in epithelial cell types. l. Bar plot showing the pathways enriched in TRB-SCs

第三类population以 SFTPB、SCGB3A2 和 SFTPC 的表达为特征，并且与与呼吸性细支气管相邻的肺泡间隔有关，在远端肺泡囊中很少见。该population共享肺泡（SFTPC 和 AGER）和气道上皮细胞（SCGB3A2 和 SOX2）的标志物特征。对这些细胞的转录调节因子分析表明，它们与肺泡 2 型细胞 (AT2s) (ZNF385B、TFCP2L1 和 ETV1) 表达的细胞重叠。由于这些细胞与典型肺泡上皮细胞（AT2s 和肺泡 1 型细胞 (AT1s)）共享转录谱和定位，我们将它们称为肺泡 0 型上皮细胞 (AT0s)。第四，观察到一种分泌纤毛的“混合”细胞类型，其特征是 SCGB3A2、SFTPB 和 FOXJ1 的共表达。这些“混合”细胞与分化纤毛（或氘核体）细胞不同，因为它们缺乏 CDC20B 和 NEK2 等的表达。 FOXJ1、SCGB3A2 和 SFTPB 的免疫染色和定量显示它们的定位特定于 3 区和 4 区。将这些细胞称为 SCGB3A2 纤毛细胞 (SCGB3A2-CCs)（整个注释过程边分析边注释）。

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观察到四种类型的基底细胞群。一种表达高水平的 TP63、KRT5、KRT17 和 IL33，类似于以前已知的气道基底细胞。第二个群体减少了 TP63 的表达，增加了分泌细胞标志物如 LTF、SCGB1A1 和 SOX21 的表达，这表明它包含分化的基底细胞。其余两个基底细胞群共表达 SFTPB 和 TP63，但显示出各种转录本的表达模式减少（KRT5、AQP5、KRT15 和 IL33）和增加（SLC34A2、BST2、RNASE1、NKX2-1 和 MUC1）表达模式。在免疫定位和定量分析的基础上，将这些细胞称为远端基底细胞 1 (distal-BC-1) 和远端基底细胞 2 (distal-BC-2)。综合转录组分析表明，KRT5-远端-BC-2 与 IPF 中发现的病理性基底细胞不同。值得注意的是，上述细胞类型在先前对包含气道所有区域的全肺样本的研究的 scRNA-seq 数据集中没有得到充分的表现。此外，转录因子调节子分析揭示了上述细胞中不同的转录网络。

Transcriptional regulation of TRB-specific epithelial cells. a. Heat map showing the enrichment of transcription factor regulons in epithelial cell types. b. Dot plots indicate the expression of transcription factors in epithelial cell types

分析比较了（ex vivo）远端和近端气道上皮细胞的表型特性。尽管colony forming efficiency没有显著差异，但两个 BC 亚群保持了各自的基因表达特征。来自远端区域的基底细胞表达 SFTPB 和 RNASE1，并显示出降低的 KRT5 表达水平，类似于它们的体内对应物。此外，基于气液界面 (ALI) 的分化培养表明，近端和远端基底细胞会产生与其各自区域相对应的腔分化细胞，这表明每个细胞都具有它们在离体维持的独特分子程序。 ALI 分化培养中近端和远端基底细胞的后代也保持与其体内对应物相对应的上皮厚度和纤毛长度。总之，这些数据分析已经确定了人类肺中分子、空间和表型不同的基底细胞亚群（单细胞、空间、白蛋空间三方面确定细胞类型的分布）。

LGR5 marks a distinct mesenchymal niche

已显示多个间充质细胞群占据不同的生态位并向肺中的相邻细胞提供感应信号。通过将 scRNA-seq 数据中的成纤维细胞与之前描述的人类肺参考数据集进行比较来注释它们。观察了七个先前确定的populations：肺泡成纤维细胞、外膜成纤维细胞、肌成纤维细胞、纤维肌细胞、周细胞以及血管和气道平滑肌细胞。值得注意的是，确定了研究的数据集独有的成纤维细胞cluster。这些成纤维细胞显著富集 LGR5、F13A1、PDGFRA、WNT5A、RSPO1、DLL1、TGFBI 和 DIO2。 ST 数据分析显示，包括 FGF14 在内的基因在气道周围的 LGR5+ 成纤维细胞中富集，但在肺泡区域不表达。 RNA-FISH 显示 LGR5+ 成纤维细胞位于气道的上皮下间质中，包括 TRB。通路分析表明，表达 LGR5 的细胞富含 WNT、PDGF、BDNF 和 TGFβ 信号通路。进一步分析表明，LGR5+ 成纤维细胞是 FGF（FGF2、FGF7、FGF10 和 FGF14）、BMP（BMP2、BMP4、BMP5 和 BMP7）和 WNT 通路配体的来源，这些配体通过它们的同源受体（FGFR2 和 FGFR3；BMPR1B 和 BMPR2；BMPR1B 和 BMPR2:FZD6）发出信号。 在远端 BC-1、远端 BC-2 和 TRB-SC 中表达。相反，远端 BC-1、远端 BC-2 和 TRB-SC 表达 PDGF 配体，其受体由 LGR5+ 成纤维细胞表达。这些数据表明以 LGR5+ 成纤维细胞和远端 BC-1、远端 BC-2 和 TRB-SC 为中心的双向信号传导。 Regulon 活性进一步表明 LGR5+ 成纤维细胞表现出独特的转录调控.

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接下来，试图确定位于远端气道中的 LGR5+ 成纤维细胞是否支持邻近基底细胞的生长和维持。 为了识别和纯化 LGR5+ 成纤维细胞，生成并稳定地将 LGR5-promoter-driven reporter construct (LGR5-mRFP) 引入来自远端气道的成纤维细胞中。 LGR5-mRFP 阳性成纤维细胞显示出与其天然组织对应物（LGR5 和 WNT5A）相似的基因表达谱。 纯化的细胞表达较低水平的肺泡成纤维细胞标记 (CA3)，表明转基因构建体忠实地概括了其表达。 远端基底细胞与 LGR5-mRFP+ 成纤维细胞单独共培养足以支持其生长并维持其分子特征，这表明 LGR5+ 成纤维细胞可作为远端气道上皮细胞的生态位。 此外，与 LGR5-mRFP+ 成纤维细胞共培养足以诱导 AT2 中远端气道标志物的表达(体外实验，证据充分)

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Organoids reveal human AT0 cell dynamics（类器官研究）

使用几种不同的计算预测算法（scVelo、Monocle3、PAGA、scEpath 和 Slingshot），观察到从 AT2 clusters到成熟 AT1 或 TRB-SC 通过 AT0 的强烈细胞轨迹。使用 MuTrans 的进一步分析表明，AT0 具有高熵，因此稳定性较低（细胞类型的熵值分析需要注意一下）。与伪时间分析相关的差异基因表达特征表明，AT0 标记在 AT2 向 AT1 或 TRB-SC 的转变过程中短暂出现。 总之，分析预测表明 AT2 可以转换为 AT0，然后可以生成 AT1 和 TRB-SC。

a, scVelo (left) and Slingshot (right) analysis of AT2s, AT0s, immature AT1s, AT1s and TRB-SCs from healthy adult distal lung tissue. Arrows indicate the predicted lineage trajectories. b, Schematic showing the predicted model.

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接下来是一些类器官研究和灵长类物种的相关研究，不是我们的重点，感兴趣的同学可以看看。方法上看，也是一些常规的生信分析方法，主要软件就是Seurat。

好了，已经分享给大家了，生活很好，有你更好，百度文库出现了大量抄袭我的文章，对此我深表无奈，我写的文章，别人挂上去赚钱，抄袭可耻，挂到百度文库的人更可耻