Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells
成人、猕猴和猪海马和内嗅细胞的转录组学分类和神经源性轨迹
发表时间：2021年
期刊：Neurons
材料：
专业名词：
allocortex：
allocortex 是皮质的较小的区域，仅占 10%； 新皮质占据了剩余的 90%。 与新皮质的六层相比，它的特点是只有三到四层皮质。
SUMMARY:
海马内嗅系统支持认知功能，在许多物种中具有终身神经原性能力，并且选择性地易患阿尔茨海默病。
为了研究神经原性潜能和细胞多样性，我们分析了人类、猕猴和猪的五个海马内嗅亚区的单核转录组。综合跨物种分析显示，成年小鼠、猪和猕猴（而非人类）神经发生的转录组学和组织学特征强大。
Doublecortin（DCX），一种被广泛接受的新生成granule cells的marker，在不同的人类神经元中被检测到，但它没有定义未成熟神经元群体。
为了探索细胞多样性的物种差异及其对疾病的影响，我们描述了亚区域特异性、转录组定义的细胞类型以及从三层大脑皮质到六层新皮质的过渡变化。
值得注意的是，METTL7B在灵长类动物中定义了subregion-specific兴奋性神经元和星形胶质细胞，与内质网和脂滴蛋白相关，包括阿尔茨海默病相关蛋白。
该资源揭示了影响海马内嗅神经发生和功能的细胞类型和物种特异性特性。
INTRODUCTION
海马结构（HIP）和内嗅皮质（EC）是记忆和时空整合广泛神经网络的关键组成部分，在阿尔茨海默病（AD）中具有选择性的易感性。根据细胞结构、细胞和回路相关特征，海马内嗅系统可分为亚区，包括较简单的dentate gyrus三层异体皮质（DG）、hippocampus proper （cornu ammonis[CA]），以及subiculum (Sub) and the more complex laminated periallocortex (mesocortex)。这些亚区域细胞类型多样性的分子基础及其与相邻新皮质细胞类型的关系尚不清楚. 该区域的层状组织和细胞结构逐渐从allocortex向neocortex转变。组织学、生理学和连接学研究表明，allocortex由谷氨酸能兴奋性投射神经元组成，类似于哺乳动物新皮层深层的神经元。
成年 DG 中granule cells的神经发生已在哺乳动物物种中得到记录并在啮齿动物中进行了广泛研究，推动了许多关于其在认知过程中的功能作用及其再生方法潜力的假设。
成体神经发生在非人类灵长类动物中也持续存在，但其水平明显低于啮齿动物。然而，关于成人 DG 中是否存在显着神经发生尚无共识。先前的研究提供了通过检测细胞增殖在成人和老年人类 DG 中产生颗粒细胞的证据。
其他研究报告了在成人 DG 中表达doublecortin（DCX；一种广泛采用的成神经细胞和未成熟神经元的）的细胞数量不同。同样，大量组织 RNA 测序显示 DCX 在成人和老年人类 HIP 中的表达，尽管显着低于发育中的人类或成年猕猴 HIP。相反，其他研究未能在人类 DG 样本中识别儿童时期后的神经祖细胞或表达 DCX 的神经母细胞。
最近，单细胞 RNA 测序已被应用于表征小鼠发育和成年阶段 DG 神经发生的过程，揭示沿granule cells谱系的基因表达级联，从radial glia-like (RGL) 细胞到neural intermediate progenitor cells(nIPC)、neuroblast cells、granule cells。该技术非常适合连接细胞谱系亚型的组织学和遗传分析，并可能解决围绕成人神经发生的争议。
在人类海马-内嗅系统中，某些细胞类型和回路选择性地易受某些病理过程的影响，包括缺血或 AD 病理以及与年龄相关的神经元丢失。 鉴于这种选择性，对该系统进行更详细的分子和细胞分析将有助于我们了解人类大脑和神经精神疾病。
为了研究基因表达、神经发生能力和可变疾病易感性方面的关键细胞类型和物种特异性差异，我们对海马的五个解剖学定义的亚区域进行了高覆盖率单核 RNA 测序 (snRNA-seq)。来自成人供体（DG、CA2-CA4、CA1、Sub 和 EC）的内嗅系统。我们还分析了成年恒河猴 (Macaca mulatta) 的 DG 细胞群和年轻成年猪 (Sus scrofa) 的所有海马区。类似于最近对死后成人海马-内嗅系统的 snRNA-seq 研究，这些发现确定了具有明显区域差异的高度多样化的细胞群。此外，我们通过与年轻成年小鼠（Mus musculus）的平行样本进行跨物种综合比较，研究了该区域内潜在的物种水平差异，支持与进化、行为和疾病。此交互式资源可在 http://resources.sestanlab.org/hippocampus 上访问。
DISCUSSION
我们报告了对成年人、猕猴和猪海马-内嗅系统中几个解剖学上定义的细胞群的广泛的单细胞转录组学分析。 我们的研究结果揭示了成年海马神经发生的基本物种差异，并描绘了从同种alloto到neocortex的细胞结构转变的分子多样性。 这些结果还概述了在某些物种和细胞类型中选择性富集的基因，这些基因可能在海马-内嗅系统的特定生物学和/或病理学中起作用。
与主要依赖一两个关键标记（progenitors [nestin]; neuroblasts and immature granule cells [DCX]）的近期研究不同，单细胞 RNA-seq 研究更加全面，因为它们利用组合基因表达谱来更可靠地识别细胞群。这种方法还允许跨物种分析，放大单个物种内的稀有信号，这些信号在单独分析时可能会被掩盖。我们的跨物种分析允许鉴定小鼠、猪和猕猴的神经源性谱系，而这在人类中几乎不存在。我们在成人 DG 样本的 32,067 个granule cells (0.003%) 中仅检测到一个具有 nIPCs 转录组学特征的细胞和一个具有推定neuroblasts特征的细胞，这一比例远低于预期的 0.09%–3.8% neuroblasts根据先前对成人 HIP 的 DCX 免疫染色或 14C 掺入研究（数据和相关研究见表 S2）。
相同的分析策略在其他分析物种中检测到更高比例的neuroblasts（小鼠，6.6%；猪，55.6%；猕猴，2.0%；图 2B；表 S3）。 这些比例高于先前基于祖细胞增殖和神经母细胞标记物（如 DCX）鉴定估计的比例（表 S2），表明需要更多研究来微调这些神经源性群体的检测。 然而，这种明显松懈的检测协议证实，我们的参数不太可能遗漏大量被调查的人类 DG granule cells中任何明显的neuroblasts群，即使它们可能表现出模棱两可的轮廓。
当人类 UMAP 布局不包括与成熟granule cells簇相邻的任何神经源性细胞聚集时，我们排除了可能的人类特异性转录组学变化对我们的跨物种综合分析的替代混淆。 同样，人类 DG 样本中不存在成熟granule cells之前的所有神经源性谱系的发现降低了人类neuroblasts存在于我们的样本中但其转录组学特征与其他物种不同并与相关细胞群混合的可能性。
我们还将我们的发现扩展到成人 HIP 的现有 snRNA-seq 数据。 我们重新评估了最近报道的由 LPAR1 标记的神经祖细胞簇的身份，LPAR1 是一种标记小鼠 DG 神经祖细胞的基因。 我们的分析表明，该簇实际上代表了由少突胶质细胞和granule cells形成的双联体（图 S3S）。 此外，Sorrells 等人对先驱 HIP 数据（Habib 等人，2017 年）的重新分析。 (2021) 表明marker为神经干细胞的细胞簇实际上是室管膜细胞的特征。
对所有分析物种中 DCX 转录物的分析表明，在成熟神经元（主要是 InNs）和神经胶质细胞中表达，表明 DCX 表达不仅限于 DG neuroblasts（图 3A 和 3B）。 这种模式与 Habib 等人对数据的重新分析一致。 迄今为止进行的所有转录组学分析都表明成人 DG 中缺乏神经源性细胞群。
在蛋白质水平上，除少数例外（图 S3L）外，DCX 仅存在于所有分析的非人类物种中类似于neuroblasts和未成熟granule cells的 DG 细胞中。此外，如前所述（还可以在其他区域检测到形态未成熟的细胞，例如猕猴的 EC 或小鼠的梨状皮层。在人类中，关于人类 DG 中 DCX 免疫染色存在激烈争议，一些报告显示阴性结果和其他人描述DCX-IL 细胞。我们在杏仁核中检测到清晰的 DCX-IL 细胞，偶尔在 EC 中检测到，但在相同的组织切片中，我们在 DG 中找不到类似于neuroblasts的 DCX-IL 细胞。检测成人 DG 中 DCX-IL 细胞的这些不一致不能完全归因于死后 DCX 蛋白的变性和降解，因为 DCX-IL 细胞在具有延长的 PMI 的样品中被清楚地检测到（图 S3D、S3E 和 S3I-S3L ）。 Moreno-Jime ́nez 等人 (2019) 报道了一种强化抗原修复方案，这是在人类 DG 中标记 DCX 细胞的必要步骤。然而，他们报告了 EC 中没有阳性细胞，这是我们的研究（图 S3D）和另一个（Sorrells 等，2021）使用传统抗原修复的相对常见的发现。因为我们的分析没有在 RNA 或蛋白质水平上揭示成神经细胞（使用不同的抗原修复方法），所以问题仍然是那些先前报道的细胞可能是什么。除了被低估的非特异性和脱靶效应（Sorrells 等人，2021 年）之外，这些研究还可以标记可能含有低水平 DCX 蛋白的成熟granule cells和 InN，这些蛋白在多步抗原修复后被特别检测到。支持这一假设的事实是，我们检测到的微弱免疫标记细胞主要在颗粒细胞层附近，表现出成熟 InN 的形态，并且一些与针对 GAD1 的抗体共同标记，GAD1 是 InN 的标志物（图3E 和 S3M-S3Q）。这种微弱的染色与在 EC 和杏仁核中显示的胞体和树突的强染色和明确形态相去甚远，并且类似于之前报道的浅 DCX 免疫染色.因此，我们的结论是 DCX 蛋白可能在 InNs 或一些成熟的granule cells中以非常低的水平表达，在正常抗原修复下可以轻微免疫标记，但在更精细的组织处理和严格条件下可以显示出更强烈和更广泛的染色抗原修复。事实上，来自 Moreno-Jime ́nez 等人的图 2I表明，大约 75% 的 DCX-IL 细胞与 NeuN（RBFOX3，75%）共定位，NeuN（RBFOX3，75%）是成熟granule cells的marker，91% 的 DCX-IL 细胞也对 Prospero homeobox1（PROX1）呈阳性，由granule cells表达的转录因子，也由尾部神经节隆突中产生的 InN 表达，支持大多数 DCX-IL 细胞实际上可能是成熟granule cells的可能性或 InN。
关于 RNA 分析，虽然人类的 PMI 比其他分析物种的时间长，但人脑在 PMI 期间的大部分时间都保持在 4°C，而用作 PMI 对照的猪则保持在室温下。 这种温暖的 PMI 可能会加剧死后效应，但这些条件并不是检测该物种神经源性途径的障碍。 可以争论的是，未检测到人类 DG 中的神经源性途径是因为我们的 snRNA-seq 策略可能会优先排除人类中的神经源性细胞。 然而，它似乎极不可能影响神经源性谱系中的所有细胞类型，从祖细胞到神经母细胞，而且只影响人类。 总体而言，对我们的 RNA 转录分析和 DCX 蛋白质研究的组合结果的最简洁的解释是，与其他分析的哺乳动物相反，在成人 DG 中不会发生持续的baseline neurogenesis或极为罕见。
表征神经源性潜力的类似物种相关和细胞特异性转录组学分析也概述了海马 - 内嗅系统中从同种皮质域到新皮质域的转变，并表明 ExNs 是子域之间差异的主要驱动因素（图 4），这表明 与基于细胞结构的传统描述相比，ExNs 的补充更丰富。 我们的分析为进一步研究这些人群提供了基础，并描述了对海马-内嗅生理的可能影响。 这些数据完善了我们对同种allo-, meso-和neocortex进化的理解。 我们开发的转录组学特征强烈表明哺乳动物同种皮层之间的同源性，特别是 EC 和新皮层的深层。
在促成层转换的基因中，我们发现 METTL7B 在海马生理和功能中很重要。 我们发现具有甲基转移酶活性的 METTL7B 与重要的 AD 相关蛋白（例如 APP、LRP1、RTN3 和 RTN4）相互作用。 重要的是，我们的结果表明，ExNs 和星形细胞亚群中的这些功能相互作用似乎是旧世界猴子和猿（parvorder Catarrrhini）的系统发育特异性物种，这些物种显示出与衰老相关的更显着的病理迹象，例如 AD。 总体而言，我们的分析提供了如何使用该资源来识别可能与海马生物学功能相关的细胞类型和基因的多个小插曲，从而允许物种间比较。