2021-04-16 花序浸染法转化拟南芥

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实验概要

1. 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理。

2. 掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法，了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用

实验原理

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点：

（1）形态个体小，生活力强,种子量大；

（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6--8周；

（3）基因组小(2n=10)，是目前已知植物基因组中最小的，但是具有完成“复杂”的植物生长发育的所有基因；

（4）拟南芥是自花授粉植物，易于获得纯合突变体。

拟南芥的培养：

将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种于MS培养基上，于22℃、光照10h培养1-2周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1）混合物上培养。

注意：湿度要大一些。

转化原理

1. 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。

2. 根癌农杆菌含有  Ti  (tumor-inducing plasmid)质粒，Ti  质粒上的  T-DNA（transferred DNA）在  Vir区（virulence region）基因产物的介导下可以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将外源目的基因插入到  T-DNA  中，借助  Ti  质粒的功能，使目的基因转移进宿主植物中并进一步整合、表达。

双元表达载体系统

双元表达载体系统主要包括两个部分：

一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基因或Lac Z基因等。

主要试剂

1．含有双元载体的农杆菌GV3101悬浮液（对数生长期）：将目的基因构 建到双元载体上，之后，将重组的双元载体转入农杆菌GV1301并用卡 那霉素（50mg/ml）筛选含有重组双元载体的菌落。将农杆菌接种在LB 液体培养基（含有庆大霉素25mg/L用于筛选Ti质粒，卡那霉素50mg/L 用于筛选T-DNA）中，28℃，180r/min条件下震荡培养至对数生长期， T-DNA 28 180r/min 在4℃和-20℃分别保存菌株备用。

2．浸染液：1/2MS，1×B5维生素，5%蔗糖，50ml/L Silwet L-77， 0.044mM benzylamino purine (10ml/L of 1 mg/ml stock in DMSO) 。或使用只加入5%蔗糖和50-500ul/L Silwet L-77的水溶液作为浸染液。（本实验选用此种浸染液） （5%蔗糖200ml 10ulSilwet L-77 ）

实验材料

农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300 ，拟南芥

实验步骤

1．在转化前三天，接种含有双元载体的农杆菌到5ml含有抗 生素（庆大霉素20mg/L，卡那霉素50mg/L）的LB液体培 养基中，28℃下震荡培养2天。

2．两天后，将1ml培养的农杆菌转移到100ml含有抗生素的 LB液体培养基中，28℃继续震荡培养24小时。（前面步骤由实验技术人员准备：保证每组有约80ml-100ml 的农杆菌，事先分装到两个50ml的离心管中。）

3．将农杆菌转入离心管中，6000rpm/min，室温条件下， 离心10分钟，然后将上清倒出。

4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。

5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。

6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。

7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。

8．大约三周后收取成熟种子。

注意事项

1. 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后，将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足horgland营养液，恢复正常培养。

2. 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。

3. 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。

4. 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分

5. 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱内长期保存。

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分子实验

作者：天明豆豆

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