高通---ChIP-Seq数据的Peak calling以及visualization

ChIP-Seq数据的Peak calling以及visualization

一、 主要分析流程

从基于bowtie2比对得到sam文件开始，对得到的4个sam文件开始下游的一系列处理（双端测序数据）：

t_A549.sam
t_LNCaP.sam
t_H2126.sam
input.sam   ##input对照

什么是对照样本？

对照样本不是必须的，一般为input DNA或IgG IP（mock IP）

二、去除PCR duplicate以降低假阳性率

PCR重复：在文库制备过程中的文库富集步骤产生；定位到同一个位置的读段一般被认为来自PCR重复，PCR重复不是有效的测序读段，将会错误地增加测序深度，如果该读段正好引入一个PCR错误，比对后将会导致支持错配的读段数增加，从而报告一个错误的SNP位点。

测序深度：测序得到的碱基总量(bp)与基因组大小(Genome)的比值,它是评价测序量的指标之一。

samtools：处理SAM、BAM、CRAM格式的工具，及鉴定SNV

#！/bin/bash
for file in *.sam
do
	echo `date`
	echo "**start to remove duplication of $file**"
	name=`echo $file|awk -F "." '{print $1}'`  ##去掉.sam
	samtools view -b -o $name.bam -@ 8 $name.sam
	samtools sort -n -@ 8 -o $name.namesrt.bam $name.bam
	samtools fixmate -@ 8 -r -m $name.namesrt.bam $name.fixmate.bam
	#为以名称排序的定位alignment填入**配对坐标**，**ISIZE**（inferred insert size猜测的插入序列大小）和**配对相应的标签**（flag）
	samtools sort -@ 8 -o $name.coordsrt.bam $name.fixmate.bam
	samtools markdup -@ 8 -r $name.coordsrt.bam $name.rmdup.bam
	##-r 删除PCR重复
	echo "**remove duplication of $file successfully!"
	echo `date`
done	

参考：samtools命令详解
https://www.cnblogs.com/emanlee/p/4316581.html
https://www.douban.com/note/341724485/

三、peak calling

使用MACS2

#!/bin/bash
for file in t_*.rmdup.bam
do 
	echo `date`
	echo "$file start peakcall"
	name=`echo $file | awk -F "." '{print $1}'`
	macs2 callpeak -t $file -c input.rmdup.bam -f BAMPE -g hs -B -n $name --outdir peakcall/$name
	#-B/--bdg	If this flag is on, MACS will store the fragment pileup, control lambda, -log10pvalue and -log10qvalue scores in bedGraph files.
	#-n/--name	输出文件（有很多个文件）的前缀
	#-g/--gsize	提供基因组的大小，程序有默认的几个物种可以选hs,mm,ce,dm
	#-f/--format	设定输入文件的格式
	echo "$file peakcall finished"
	echo `date`
done

这里分析使用的数据没有做重复，但一般会有2次或更多次的生物学重复，这时后续分析前需要得到两个重复样本之间一致性的peaks（之后再研究吧55555。。。。）

四、HOMER注释

注释原理为计算每个峰中心位置与最近的基因转录起始位点（TSS）的距离

annotatePeaks.pl A549_peaks.narrowPeak hg19 > t_A549_peaks_ann.txt 2>ann.log.txt

五、IGV可视化

生成bam文件的索引文件.bai，然后使用deeptools将bam转换成.bw，将.bw导入IGV

(base) [stu18230119@node3 ~]$ pip install deeptools  ##安装deeptools

for file in *.rmdup.bam
do 
samtools index $file
done

for file in *.rmdup.bam
do 
name=`echo $file |awk -F "." '{print $1}'`
bamCoverage -b $file -o $name.rmdup.bw -p 5 --normalizeUsing RPKM
## --region / -r CHR:START:END  选取某个区域统计
done

Deeptools安装

BAM神器—Deeptools使用指南