Featurecount to RPKM计算

参考：

基因长度之多少
Htseq Count To Fpkm

由公式可知，知道了featurecount count 矩阵，同时有基因长度信息，可以计算RPKM.
FPKM= read counts / (mapped reads (Millions) * exon length(KB))
目前最关键是如何计算基因长度，以及如何衡量基因长度。

我们就能理解目前主流定义基因长度的几种方式。

• 挑选基因的最长转录本
• 选取多个转录本长度的平均值
• 非冗余外显子(EXON)长度之和
• 非冗余 CDS（Coding DNA Sequence） 长度之和

实践

下面列举的是 非冗余外显子(EXON)长度之和 计算方法

image.png

其他尝试

1.TPM FPKM 计算公式R

• 群主解答
• TPM ，RPKM计算，首先需要求得count 数，再用R函数转换。

countToTpm <- function(counts, effLen)
{
  rate <- log(counts) - log(effLen)
  denom <- log(sum(exp(rate)))
  exp(rate - denom + log(1e6))
}

countToFpkm <- function(counts, effLen)
{
  N <- sum(counts)
  exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) )
}

fpkmToTpm <- function(fpkm)
{
  exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6))
}

countToEffCounts <- function(counts, len, effLen)
{
  counts * (len / effLen)
}

2. python 可能代码

import numpy as np
import pandas as pd
A=pd.DataFrame({"gene_length":[2,4,1,10],
              "sample1":[10,20,5,0],
              "sample2":[12,25,8,0],
              "sample3":[30,60,15,1]})
A.index=np.array(["A","B","C","D"])


#apply 列作为变量
def count_fpkm(A):
    B=A[["sample1","sample2","sample3"]].apply(lambda x:x/sum(x))
    C=B.div(A["gene_length"].values,axis=0).applymap(lambda x:"{:.2f}".format(x))
    return C


def count_TPM(A):
    B=A[["sample1","sample2","sample3"]].div(A["gene_length"].values,axis=0)
    C=B.apply(lambda x:x/sum(x))
    return C

3.gtftools 工具计算基因长度

http://genomespot.blogspot.com/2019/01/using-gtf-tools-to-get-gene-lengths.html
gtftools工具使用

wget http://www.genemine.org/codes/GTFtools_0.6.9.zip

• 计算结果

  
  
  image.png

思考：

• 当初以为gene length 就是gtf 第三列标注为gene的那个长度，而没有考虑内含子区域，最近才明白需要计算外显子之和。
• 目前计算gene length 已经有好多工具
• TPM,RPKM 直接定量工具也很多，比如cufflink【rpkm】,stringtie【rpkm,TPM】.需要注意的是：
  1.hisat2 需要添加特定参数进行比对，才可以与cufflink 进行配套使用，否则会报错；

2. stringtie 可以方便计算TPM,但是每一次计算的gene数目不一样，比如有时候20001，20005 不等，需要手动过滤一些不相关的gene
3. 有时候cufflink 和 featurecount 计算方式不一样，导致两者分别计算rpkm结果会有偏差。

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