为什么想要的gene克隆了n多次都得不到？是不是应该考虑下反转录……

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通常来说，真核生物的基因，这里主要指的是植物gene的克隆，常以cDNA为模板进行克隆。这就有个问题，很多同学想要的基因尝试克隆了N多次都拿不到，这就很恼火，连基因都拿不到，还搞什么？

问题的关键应该首先考虑cDNA。

只要cDNA没有问题，那理论上肯定可以克隆到想要的基因。这就不得不考虑RNA的质量以及反转录质量。只有谨慎操作，从源头避免问题，才能在后续实验中规避掉尽可能多的意外bug

RNA提取的注意事项

RNA的质量几乎决定了后续实验的成败。常见的挑战有：RNA降解、低纯度、低产率及DNA污染等。
1 采样后立即稳定RNA
RNA不稳定，极易降解。许多样品含有高水平的RNase，会快速降解RNA。
为保证RNA最大程度的稳定，应在采样后立即置于液氮，并尽快提取RNA。2 确保样品充分溶解
这是提高RNA产量和质量的重要一环。3 消除DNA污染注意：目前RNA的提取已十分便捷，只需按照试剂盒操作步骤严格执行，基本上不会出现大的问题。

反转录原理

（上）真核生物mRNA结构的最大特征是5‘端的帽子结构及3’端的多（A)结构。也正因如此，常用oligo dT片段与mRNA上的多（A)相配对，作为反转录的引物，可由此获得mRNA的全长。
（中）此外，针对真核生物mRNA的反转录，还可采用基因特异性引物，仅扩增需要的cDNA。该引物在后续还可以作为PCR的反向引物。（下）随机引物。

检查RNA的完整性

RNA的质量直接影响了cDNA的质量。而不用时间节点采样，提取的RNA质量也会有差异，因此有必要在RNA提取后检查RNA的质量及完整性。通常完整的真核生物RNA包括28S和18SRNA条带，两条带的亮度应差不多。

基因的克隆

即使十分小心的提取了RNA，又十分谨慎的进行了反转录拿到了cDNA，有时还是无法得到自己想要的DNA，一遍一遍又一遍……
这时或许可以从以下几个方便考虑：
1 使用多个不同批次的cDNA模板分别克隆；
2 将多个批次的cDNA模板混匀后进行克隆；
3 如果以上两种方法均未果，可针对目的基因设计基因特异性引物，获取目基因cDNA后再克隆（小概率事件，但我觉得有必要尝试。因为真核生物mRNA几乎无一例外都有多（A）尾巴）；
4 如果以上三种方法都未果，那就有可能是个假基因，或许有必要从基因本身的结构考虑。

“但愿每次回忆，对生活的都不感到负疚。”

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