hello，周三了，又是新的一周，但是内心29周岁而立之年的焦虑始终挥之不去，甚至害怕孤独终身的感觉，，阿甘正传有一句台词，“你以后想成为什么样的人？” “什么意思，难道我以后就不能成为我自己了吗？”，希望大家都能成为内心的自己。
好了，又到了我们单细胞空间联合分析的时间了，今天分享的文献在Single-nucleus RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics Reveal the Immunological Microenvironment of Cervical Squamous Cell Carcinoma,希望单细胞空间能给我们带来医疗上新的突破。
Abstract
如今，晚期浸润性宫颈癌的有效治疗仍然具有挑战性。本文采用单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 和 SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing (Stereo-seq) 技术研究宫颈鳞状细胞癌 (CSCC) 的免疫微环境，这是一种主要类型的宫颈癌。除 LGALS9 和 IDO1 外，CSCC 肿瘤和炎症区域中大多数免疫检查点基因的表达水平均不显著高于非癌症样本中的表达水平。 CD56+ NK细胞和未成熟树突状细胞在高代谢肿瘤区信号较强，而在低代谢肿瘤区发现更多嗜酸性粒细胞、未成熟B细胞和Treg细胞。此外，在一些肿瘤周围发现了一组癌症相关成纤维细胞 (CAF)，它们高度表达 ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP。 CAFs可能通过抑制淋巴细胞浸润和重塑肿瘤细胞外基质来支持肿瘤的生长和转移。此外，CAF 与 CSCC 患者较差的生存概率相关，并且可能存在于一小部分 (~20%) 晚期癌症患者中。总的来说，这些发现可能会增强对 CSCC 免疫微环境的理解，并为晚期 CSCC 的治疗提供一些启示。
Introduction
宫颈癌是影响全球女性健康的第四大常见癌症，尤其是在低收入和中等收入地区。目前，超过 12 种人乳头瘤病毒 (HPV) 具有致癌性。其中，HPV16 占 60%-70% 宫颈癌病例，尤其是宫颈鳞状细胞癌（CSCC）。 自2018年以来，世界卫生组织（WHO）呼吁全球消除宫颈癌，量化疫苗接种、筛查和疾病治疗/管理等方面的行动，这需要各方共同努力数十年。
虽然早期宫颈癌接受根治性子宫切除术可以达到良好的预后，但晚期宫颈癌的5年总生存率或无病生存率并不理想。目前，化疗（如紫杉醇、顺铂、贝伐单抗等）放疗仍是转移性或复发性患者的主要姑息治疗，缓解率低（48%），生存期短（17个月）。免疫疗法通过逆转耗尽或抑制的免疫活动，为治疗无法治愈的宫颈癌带来了新的希望。针对程序性细胞死亡 1 (PD1)、程序性细胞死亡配体 1 (PD-L1) 和细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4 (CTLA4) 的免疫检查点阻断 (ICB) 药物目前正在针对复发性/转移性宫颈癌进行试验。不幸的是，对 ICB 治疗的总体反应率很低，从 4% 到 26% 不等。阐明 CSCC 的免疫状况，尤其是 TME 中的免疫抑制状态，可能有助于我们更好地解决这一现象并调整我们对宫颈癌的治疗策略.
单细胞测序和空间转录组学是揭示肿瘤细胞异质性和微环境的最先进工具，但这些技术在 CSCC 研究中的应用仍然有限。 在这项研究中，收集了 20 名个体的宫颈样本，并结合单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 和 SpaTial 增强 REsolution 组学测序 (Stereo-seq) 技术来研究 CSCC 的免疫学特征。 破译 CSCC 的免疫微环境将为晚期 CSCC 的治疗提供新的见解，这可能会加速宫颈癌的消除。
Results
snRNA-seq data revealed the cellular composition of CSCC
为了充分表征宫颈组织的细胞组成，收集了 5 名患者的 CSCC 样本进行 snRNA-seq。共有 67,003 个细胞和 30,996 个基因通过质量控制，根据典型细胞标记物从中鉴定出 14 种细胞类型，包括癌细胞（6,960）、柱状上皮细胞（CEC，22,396）、内皮细胞（6,340）、平滑肌细胞(4,502)、成纤维细胞 (9,836)、B 细胞 (689)、单核细胞 (5,281)、T 细胞 (4,930)、调节性 T (Treg) 细胞 (1,081)、浆细胞 (3,236)、髓样树突状细胞 (DC) (955) )、浆细胞样 DC (272)、肥大细胞 (384) 和自然杀伤 (NK) 细胞 (141)。子宫颈在其表面包含两种类型的细胞，在外宫颈上具有分层的鳞状上皮细胞，在宫颈内膜和隐窝上具有简单的柱状上皮细胞。鳞状上皮细胞发育异常导致CSCC。因此，癌细胞主要表达鳞状细胞的已知CSCC相关基因SERPINB3（Serpin家族B成员3）、肿瘤基因TP63、CDKN2A和角蛋白基因KRT15。由于组织主要来自晚期癌症患者（FIGO IB2-IIIC1 期；在化疗前的宫颈活检过程中收集了没有分期信息的组织），因此很少分离出正常的上皮鳞状细胞。将 snRNA-seq 读数与高风险 HPV 参考基因组作图显示，癌细胞中存在病毒基因。还发现了一大群柱状上皮细胞，它们高度表达 MUC5B 和 WFDC2。这种细胞类型主要位于子宫颈上皮，但也可以出现在成人子宫颈和一些腺体的鳞柱交界处。平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞是构成宫颈基质的主要细胞类型。平滑肌细胞高表达MYH11、MYLK、ACTG2、COL3A1和COL1A1，成纤维细胞除COL3A1和COL1A1外高表达LAMA2，而内皮细胞可通过EMCN、FLT1和EGFLT的高表达来区分。除了子宫颈的结构细胞外，还鉴定了多种免疫细胞类型，其中单核细胞（ITGAX、MX4A7）、T 细胞（CD3E、CD247）和浆细胞（MZB1、IGKC）最为丰富。简而言之，snRNA-seq 数据揭示了 CSCC 组织的结构和免疫细胞组成，有助于使用特定细胞基因表达谱进行下游空间转录组分析。
Spatial transcriptomic characterization of CSCC
空间信息对于理解组织中的细胞-细胞相互作用至关重要，不幸的是，snRNA-seq 数据中缺少这些信息。因此，我们利用 Stereo-seq 来获取原位基因表达谱。包含捕获探针的 Stereo-seq 芯片包含 25bp 坐标标识条形码、10bp 分子标识条形码和 22bp 用于 mRNA 杂交的 polyT 尾。获得来自 2 名非癌症患者和 14 名 CSCC 患者的宫颈样本并将其嵌入 OCT。从每个 OCT 块中解剖 10 μm 厚的连续冷冻切片，用于立体序列、苏木精和伊红 (H&E) 染色和免疫组织化学 (IHC) 染色。最终，总共成功获得了 18 张 Stereo-seq 载玻片。其中包括来自 2 名非癌症患者的 3 张载玻片和来自 14 名 CSCC 患者的 15 张载玻片。因为样本都来自不同的解剖部位，所以它们都被包括在内以弥补样本量小。 Stereo-seq 芯片中的捕获点直径为 220 nm，两个相邻点之间的中心距为 500 nm。捕获点被分组到bin中，以包含足够的基因以进行准确的聚类。初步分析显示，肿瘤区域的 RNA 丰度远高于基质区域。为了平衡肿瘤和基质之间的表达差异，在 bin 100（100 x 100 点）处对 CSCC Stereo-seq 载玻片进行了注释，以充分展示组织组成，其覆盖面积约为 49.72 x 49.72 μm。 CSCC Stereo-seq 载玻片的每个 bin 的平均基因数范围为 1,767 到 4,152。由于来自非癌症患者的三张 Stereo-seq 载玻片的基因表达强度低于 CSCC 载玻片，因此它们在 bin 200 (99.72 x 99.72 μm) 处进行了注释。统一流形逼近和投影 (UMAP) 分析表明，CSCC 和非癌症的 bin cluster 倾向于相互分离，而 CSCC 的 bin 集群则表现出一定的收敛性.
考虑到癌组织的复杂结构，根据专业病理学评估（基于 H&E 和 IHC 染色结果）和标记基因表达模式手动进行 Stereo-seq 载玻片的初始注释。在CSCC 样本中通常鉴定出六种类型的组织clusters，包括肿瘤、间质（无明显炎症）、炎症（具有弥漫性炎症或局灶性炎症的间质）、腺体、血管和坏死。肿瘤、间质和炎症cluster广泛分布在 CSCC 样本的 Stereo-seq 载玻片中，某些样本包含坏死、腺体和血管。根据基因表达谱，组织clusters可以进一步划分为带有数字后缀的subclusters。应该记住，空间clusters实际上是定义区域内的细胞的混合，但由其主要特征决定。例如，肿瘤clusters并非纯粹由癌细胞组成，但也可能包含其他细胞类型，但数量很少，如免疫细胞、成纤维细胞等。组织特异性基因也显示出空间模式。癌性鳞状细胞相关基因如 KRT5、CDKN2A 和 SERPINB3 主要富集在 Stereo-seq 肿瘤区域，IGKC 和 IGLC2 富集在炎症区域，VIM 在基质区域，ADRA2A 在血管中，MUC5B 在腺体中。捐献 15 份样本的 14 名 CSCC 患者均为 HPV 阳性，其中 85.7%（12/14）感染 HPV16，7.1%（1/14）感染 HPV33，7.1%（1/14）感染 HPV58。 HPV读数覆盖了病毒基因组的8% - 100%（约600bp - 7905bp），主要在肿瘤区域进行鉴定。空间可视化展示了同一样本不同肿瘤部位病毒基因的不同捕获信号，经常观察到 E5、E6、E7 和 L1。相反，在非 CSCC 样本中仅鉴定出边缘 HPV reads。一般来说，在 Stereo-seq 肿瘤区域观察到比其他区域更高的转录和翻译活性、细胞增殖、氧化磷酸化和免疫反应。 Stereo-seq 载玻片的初始手动注释用于辅助 TME 的下游分析。
Variable immune inhibition in CSCC
关于 ICB 治疗对宫颈癌的低反应率，决定仔细研究 CSCC 的免疫状况以寻找线索。在 snRNA-seq 和 Stereo-seq 数据中评估了具有不同免疫功能的三个基因组的表达谱，即共刺激、细胞毒性/效应和共抑制/耗竭。在单细胞水平，共刺激基因在先天免疫和适应性免疫细胞中均有表达，特别是在 Treg、T 和 NK 细胞中。发现 Treg 细胞高度表达 CD27、CD28、CD40LG、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4 和 TNFRSF9。虽然这些基因是 Treg 细胞成熟和正常抑制功能所必需的，但 Treg 细胞中 CD27 的过表达可能会抑制抗肿瘤免疫反应。在空间上，共刺激基因倾向于富集在肿瘤和炎症区域。特别是，TNFRSF18（也称为糖皮质激素诱导的TNF受体，GITR）在炎症和肿瘤区域普遍表达。然而，它的表达也在非癌症样本的上皮细胞中上调。在snRNA-seq 数据中，该基因主要在 Treg、NK、T 细胞和肥大细胞中检测到。尽管 TNFRSF18 与肿瘤中 Treg 细胞的免疫抑制有关，但其高空间表达水平可能是由多种类型的免疫细胞共同促成的。免疫细胞毒/效应基因主要由 T 和 NK 细胞表达，其中一些在 Stereo-seq 载玻片中的炎症和肿瘤区域通常上调，包括 GNLY、GZMA、GZMB 和 NKG7。这些基因主要由 NK 细胞表达，表明它们在针对 CSCC 的细胞毒性反应中的重要作用。对于共抑制/耗竭基因，未能在我们的 Stereo-seq 数据中检测到 CTLA4 和 PD-1 的任何显著表达，尽管 CTLA4 可以由 Treg 细胞高度表达，而 PD-1 可以由 Treg、T 和 NK 细胞高度表达. PD-L1 主要由浆细胞样 DCs 表达，仅在一小部分 Stereo-seq 样本的肿瘤或炎症区域过表达。虽然 CD276、ENTPD1、IDO1、LGALS9 和 VSIR 通常在 Stereo-seq 样本中检测到，但与非癌症样本相比，CSCC 样本中似乎只有 IDO1 和 LGALS9 具有更高和更广泛的表达。这两个基因都由 DCs 表达并且可以下调细胞毒性 T 细胞的活性。 IDO1 和 LGALS9 是否可以比 CTLA4 和 PD-L1 成为 ICB 治疗 CSCC 的更好靶点仍有待探索。此外，当放大检查同一张 Stereo-seq 载玻片中的免疫基因时，它们的表达在不同肿瘤区域之间可能会有很大差异。在样品 TJH08 中，肿瘤区域通常表达高 IDO1、低 PD-L1 和非常低的 CTLA4。相比之下，样品 TJH37201 中只有一个肿瘤区域表达了这些基因。总的来说，尽管 snRNA-seq 和 Stereo-seq 数据都显示了 CSCC 患者免疫衰竭的证据，但患者之间和患者内部的免疫微环境差异很大。
Metabolic statuses of tumors were associated with different immune responses
代谢可以调节肿瘤的免疫微环境，这可能是癌症治疗的干预目标。分别对六种途径进行了基因集变异分析（GSVA），包括缺氧、乳酸、糖酵解、脂质代谢、磷酸戊糖和氧化磷酸化途径。然后将上述六种途径的GSVA评分的平均值计算为每个肿瘤区域的代谢评分。根据 GSVA 代谢评分，排名前 20 位的 Stereo-seq 肿瘤clusters被归类为高代谢肿瘤，排名后 20 位的肿瘤clusters为低代谢肿瘤。一般来说，高代谢肿瘤在氧化磷酸化、糖酵解和乳酸途径中表现出更高的活性，表明增殖的癌细胞中存在活跃的有氧糖酵解，即 Warburg 效应。此外，高代谢肿瘤还伴有严重的缺氧和活跃的脂质代谢，表明快速生长的肿瘤存在强烈的氧化和营养应激。为了进一步探索代谢和免疫反应之间的关系，计算了高代谢和低代谢肿瘤区域内每个 bin 的不同免疫细胞的 GSVA 特征评分。根据每个肿瘤区域的平均特征评分，观察到几种细胞类型的显著差异。 CD56+ NK 细胞和未成熟树突状细胞在高代谢肿瘤区域显示出比低代谢肿瘤区域更强的信号，表明高代谢肿瘤可能更容易与先天免疫反应相关。同时，低代谢肿瘤区嗜酸性粒细胞、未成熟B细胞和Treg细胞较多，提示适应性免疫反应无效。两个 Stereo-seq 样本 TJH34 和 TJH35 包含高代谢和低代谢肿瘤区域。分别使用 TOP2A 和 MS4A1 作为癌细胞和 B 淋巴细胞的标志物，可视化代谢和 B 细胞分布之间的空间关联。在低代谢肿瘤区域内外检测到传播 MS4A1 表达，与 H&E 图像中的淋巴细胞分布模式和 GSVA 特征评分一致。
Identification of a cluster of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in CSCC
在探索样本 TJH34 中高代谢和低代谢肿瘤区域之间的免疫差异时，注意到高代谢肿瘤区域之外的独特空间clusters。这个clusters与大多数基质clusters不同，看起来像一条包围肿瘤的丝带。由于这个clusters是基质的一部分，仔细检查了snRNA-seq 数据中的成纤维细胞。幸运的是，从所有五个样本中鉴定出一小组成纤维细胞，它们高度表达报告的 CAF 标记基因，包括 ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP。 CAF 的干性评分低于癌细胞和成纤维细胞，并且处于不同的细胞周期阶段。基于标志性基因集的功能富集表明，CAFs 与成纤维细胞和癌细胞具有共同的活性。 CAF 参与了成纤维细胞的类似途径，包括紫外线反应下降、血管生成、肌生成和上皮-间质转化。对于包括 p53 通路、KRAS 信号通路、雌激素反应、有丝分裂纺锤体、G2/M 检查点和 E2F 靶点在内的通路，CAF 显示出与癌细胞相似的活性。在基因水平上，CAFs不仅高表达成纤维细胞的标志基因，如胶原蛋白家族（COL1A1、COL3A1、COL4A1、COL5A2、COL6A3等），而且还高表达恶性鳞状细胞的标志基因，如KRT4、KRT13的角蛋白家族。尽管癌症中的 CAF 可能具有不同的起源，但上皮特征表明 CSCC 样本中 CAF 的起源可能与 EMT 相关。
为了定位 CAF 在 CSCC 组织中的空间分布，采用多模态交叉分析 (MIA) 方法(参考文章MIA用于单细胞和空间的联合分析）整合 snRNA-seq 和 Stereo-seq 数据。简而言之，该方法计算了由 snRNA-seq 数据识别的细胞类型特异性基因和由 Stereo-seq 数据表征的区域特异性基因的表达水平的重叠程度。得到的 p 值越小，在后面的描述中被称为 MIA 分数，定义的细胞类型和空间区域之间的相关性越强。最初的 MIA 结果表明，Stereo-seq 聚类结果符合相应区域的预期细胞组成。不幸的是，仅 MIA 评分并不能完全反映细胞的空间特异性，尤其是在 RNA 丰度较低的区域。因此，通过实验证实与 CAF 相关的 POSTN 的高表达水平和 CAF 的高 MIA 分数同时用于定义 CAF 的 Stereo-seq clusters。结果显示，在 15 张 Stereo-seq 载玻片中的 4 张中，CAF 在某些肿瘤区域周围富集，包括样品 TJH34 的高代谢肿瘤区域。通过使用相同样本的连续组织切片对 POSTN 进行 IHC 染色，进一步证实了 CSCC 中 CAF 的存在。值得注意的是，并非所有的肿瘤区域都被 CAF 包围，这让我们对与这些细胞的存在相关的生物学差异感到好奇。
CAFs might facilitate the growth and metastasis of CSCC from diverse aspects
为了全面揭示 CAFs 在 CSCC 中的生物学功能，我们将 Stereo-seq 载玻片中的肿瘤区域分为两种类型：被 CAFs 包围的肿瘤区域（CAFs+ 肿瘤）和未被 CAFs 包围的肿瘤区域（CAFs-肿瘤）。 发现三张 Stereo-seq 载玻片同时包含 CAFs+ 和 CAFs- 肿瘤区域，并用于下游分析。 然后，我们使用 3 个样本的 CAFs+ 和 CAFs- 肿瘤区域之间上调和下调的 DEG (|Log2FC| > 1.28, P <0.05) 进行 GO 富集分析。 结果表明，CAFs+ 肿瘤在能量使用、代谢、有丝分裂和细胞生长方面比 CAFs- 肿瘤更活跃。 同时，CAFs+肿瘤中的细胞粘附、细胞凋亡和免疫反应均被下调。 上述观察结果与 CSCC 的免疫和代谢异质性相吻合，特别是在 TJH34 样本中。 这些表明CAF的存在可能从不同方面支持肿瘤进展。
为了全面揭示 CAFs 在 CSCC 中的生物学功能，将 Stereo-seq 载玻片中的肿瘤区域分为两种类型：被 CAFs 包围的肿瘤区域（CAFs+ 肿瘤）和未被 CAFs 包围的肿瘤区域（CAFs-肿瘤）。发现三张 Stereo-seq 载玻片同时包含 CAFs+ 和 CAFs- 肿瘤区域，并用于下游分析。然后，我们使用 3 个样本的 CAFs+ 和 CAFs- 肿瘤区域之间上调和下调的 DEG (|Log2FC| > 1.28, P < 0.05) 进行 GO 富集分析。结果表明，CAFs+ 肿瘤在能量使用、代谢、有丝分裂和细胞生长方面比 CAFs- 肿瘤更活跃。同时，CAFs+肿瘤中的细胞粘附、细胞凋亡和免疫反应均被下调。上述观察结果与 CSCC 的免疫和代谢异质性相吻合，特别是在 TJH34 样本中。这些表明 CAFs 的存在可能从不同方面支持肿瘤进展。
接下来，计算了 993 个关于免疫基因集的个体 bin 的基因模块表达分数，以评估免疫细胞丰度。结果显示 CAFs+ 肿瘤中 B 细胞、CD4 T 细胞、CD8 T 细胞、中性粒细胞、DC、NK 细胞和 Th1 细胞的数量显著减少，表明 CAF 可能作为防止原免疫细胞浸润的物理屏障。肿瘤区域。虽然在 CAFs+ 肿瘤区域发现了更多的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)，但 M1（肿瘤抑制）和 M2（肿瘤促进）表型的分布却相反。由于样本量小，巨噬细胞信号较弱，不确定不同表型的 CAF 和 TAM 之间的关系。
作为基质的一部分，CAF 必须与癌细胞、基质细胞和免疫细胞密切相互作用。事实上，对 snRNA-seq 数据的分析显示了 CAF 与其他细胞之间关于细胞外基质 (ECM) 形成和细胞间接触的潜在相互作用。 CAFs高表达的胶原蛋白家族基因，特别是COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL4A2、COL4A5、COL6A1、COL6A2和COL6A3）可能与免疫细胞和平滑肌细胞表达的CD44相互作用，可能参与细胞粘附和迁移。胶原蛋白还可能与癌细胞、免疫细胞和基质细胞表达的整合素家族的不同成员相互作用。同样，由 CAF 表达的 FN1（纤连蛋白 1，一种可溶性糖蛋白）和层粘连蛋白（LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、LAMC1、LAMC3）也可能通过整合素与其他细胞类型相互作用。整合素是由α和β亚基组成的膜受体蛋白，参与细胞粘附和识别。 CAFs 似乎使用不同的异二聚体形式的整合素来接触其他细胞类型。它们可能通过由α2β1、α3β1和αvβ8亚基组成的整合素与癌细胞相互作用，而通过由α9β1、α6β1和α1β1亚基组成的整合素与内皮细胞、CEC、平滑肌细胞相互作用，并通过由亚基α9β1、α6β1和α1β1组成的整合素与T细胞和NK细胞相互作用。由α1β1亚基组成的整合素。重要的是，CAFs 可能利用 F11R（也称为 JAM1，连接粘附 313 分子 1）通过 F11R 和 JAM3 与癌细胞和基质细胞形成紧密连接，这可能会阻止免疫细胞的浸润。 CAF 还可能表达其他基质蛋白，包括 THBS1（血小板反应蛋白 1）、THBS2 和 TNC（肌腱蛋白 C），通过 CD44、整合素（α3β1）和 SDC1 与免疫细胞、平滑肌细胞、癌细胞和浆细胞进行交流。此外，CAF 过表达几种组织重塑因子，包括 POSTN（骨膜素，一种分泌的 ECM 蛋白）、FAP（成纤维细胞活化蛋白，一种丝氨酸蛋白酶）、MMP1（基质金属蛋白酶 1）、TNC（肌腱蛋白-C，一种基质蛋白）和LOXL1（赖氨酰氧化酶 1，催化胶原蛋白和弹性蛋白的交联）。这一证据表明 CAF 在塑造肿瘤细胞外环境中的关键作用。
除了它们在 ECM 构建中的作用外，CAF 还可能通过过度表达包括 SEMA3C、POSTN、CXCL6 在内的分泌因子来增强癌细胞的干性和增殖。据报道，SEMA3C 可促进癌症干细胞维持、血管生成和侵袭。 POSTN 可以通过整合素 αvβ3 激活 Akt/PKB 通路来提高癌细胞的存活率。它还可以通过 PTK7-Wnt/β-Catenin 信号通路促进癌症生长。CXCL6（CXC 基序趋化因子配体 6），尽管主要与免疫相关响应，据报道促进食管鳞状细胞癌的生长和转移。CAFs 中的另一个高表达基因 SNAI2 (Slug)，一种蜗牛相关的锌指转录因子，可能抑制细胞凋亡并促进癌症进展。几种常见的生长因子CAFs也表达TGFB1（转化生长因子β1）、EGF（表皮生长因子）和VEGFA（血管内皮生长因子A）。此外，CAFs 中 LSD1（组蛋白赖氨酸去甲基化酶 1）的上调可能会抑制 IFN 激活以逃避免疫攻击。CAFs 产生的 Wnt5a 信号蛋白也可能抑制免疫反应以促进肿瘤转移。总之，CAFs 可能能够增强 TME，促进肿瘤的进展。
The presence of CAFs was associated with poorer clinical statuses of CSCC
为了验证 CAF 的促肿瘤发生作用，首先使用来自癌症基因组图谱 (TCGA) 的数据集进行生存分析，该数据集包含 252 名 CSCC 患者。使用标记基因集计算每个 CSCC 患者的 CAF 的 GSVA 评分 ( ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP）。毫不奇怪，较高的 CAF 信号预示着不利的无进展生存期（HR = 1.66, 95%CI = 1.03-2.67, P = 0.038）和总生存期（HR = 1.69, 95%CI= 1.00-2.84, P = 0.05）对于 CSCC 患者。接下来，使用独立的样本集测量了 CAF 的生物标志物 POSTN 在基质和肿瘤区域的表达水平，该样本集由 65 个存档的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) CSCC 样本组成。基于染色强度和分布模式，为每个样本分配了 POSTN 染色分数。基质中 POSTN 表达的总体阳性（弱、中和强）率远高于肿瘤区域。然而，只有 21.1% (14/65) 的 FFPE 样本在肿瘤周围的基质中具有中度或强的 POSTN 染色。卡方检验显示，基质中 POSTN 的高表达水平与更晚期的病理分期、更差的分化、更大的肿瘤大小、更高的外周血鳞状细胞抗原（SCC）浓度和年龄显著相关，这进一步证实了CAF 的促肿瘤发生能力。
总的来说，我们的结果表明 CAF 是 CSCC TME 的重要组成部分，形成了保护癌细胞免受免疫监视和清除的屏障。 它们还可能有助于刺激细胞增殖和血管生成，抑制细胞凋亡，并重建 ECM 以增强肿瘤转移。
Discussion
尽管疫苗和根治性子宫切除术是预防和治疗宫颈癌的有效措施，但复发/转移性宫颈癌的治疗仍然是实现消除宫颈癌目标的一大障碍。 在此，描述了结合 snRNA-seq 和 Stereo-seq 技术的 CSCC 的高分辨率免疫学lanscope，这可能有助于 HPV 诱导的宫颈癌的管理和治疗。
如今，ICB 疗法，尤其是那些使用 PD-L1/PD-1 和 CTLA4 抑制剂的疗法，是治疗转移性宫颈癌的新方法之一。几项研究报道了 PD-L1 在宫颈癌中的广泛表达，阳性率从 34% 到 96% 不等。然而，单独的 PD-L1 表达与宫颈癌患者的疾病结果无关。事实上，对 PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 抑制剂的反应率在不同的试验中波动很大，而且疗效似乎与相关检查点基因的表达状态无关。在我们的研究中，除了 LGALS9 和 IDO1 外，CSCC 肿瘤和炎症区域中大多数免疫检查点基因的表达水平不显著高于非癌症样本中的表达水平。 LGALS9（即半乳糖凝集素 9）通过与 T 细胞表面的 Tim-3 结合或抑制 DC 的抗原呈递能力来下调效应 T 细胞免疫。虽然显示半乳糖凝集素 9 信号通路的破坏可诱导患有胰腺导管腺癌的小鼠的肿瘤消退，但在肺转移小鼠模型中报告了相反的效果。 IDO1 主要在 DC 中表达，有助于将色氨酸降解为犬尿氨酸，从而抑制 T 细胞功能。发现抑制 IDO1 可以增强 HeLa 和 SiHa 肿瘤球细胞的放射敏感性，表明 IDO1 抑制剂作为放射增敏剂的潜在应用。靶向 LGALS9 和 IDO1 能否改善 CSCC 的治疗需要进一步探索。我们的研究还揭示了代谢活性低的肿瘤区域的抑制性适应性免疫，突出了代谢调节在 TME 中的关键作用。事实上，最近的临床试验已将检查点抑制剂与针对葡萄糖、氨基酸和核苷酸代谢的代谢药物结合使用。更好地理解免疫反应和新陈代谢之间的串扰将进一步有利于癌症治疗。
CAF 已在多种类型的癌症中得到表征，并可分为不同的亚型。虽然细胞系研究暗示了 CAF 在宫颈癌细胞增殖中的支持作用，但这是第一项系统描述 CSCC 临床样本中促肿瘤 CAF 的空间分布和生物学特性的研究。由于组织异质性，CAFs 的标记基因因癌症而异。在本研究中，ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP 是识别 CSCC 中 CAF 的充分标记基因。其他基因如 KRT4、ITGA1、COL24A1 和 COL7A1 可能作为 CSCC 中 CAF 的互补标记基因，它们显示成纤维细胞和癌性鳞状细胞的细胞特性。这些 CAF 对 TME 的异质性有显著贡献，TME 通过促进肿瘤生长、转移和免疫逃避而显示出促肿瘤发生表型。 CAFs+肿瘤增殖活跃，但缺乏淋巴细胞浸润。将这些免疫逃避肿瘤暴露于免疫系统对于根除癌细胞至关重要。然而，并非所有的 CSCC 样本都呈 CAF 阳性。 Stereo-seq 实验中只有 28.6% (4/14) 的 CSCC 患者显示存在 CAF，而 IHC 实验中只有 21.1% (14/65) 的 FFPE 样本对 CAF 的生物标志物 POSTN 呈阳性。由于 CAF 往往与更高级的病理状态相关，因此它们可能在个体差异很大的浸润性癌症患者中发挥作用。研究人员已尝试使用抗体或抑制剂干扰 CAF 的激活、作用和正常化过程，正在进行几项临床试验。由于 CAF 高度表达的基因对正常组织也是必不可少的，因此它们的功效和副作用需要密切监测。
In conclusion, our data have demonstrated the high heterogeneity of viral gene expression, immune response, and metabolism in CSCC, indicating that combined drugs or therapies targeting multiple biological processes would be better practice to treat CSCC. Interventions on CAFs and tumor metabolism may complement the current treatments of CSCC. Further investigations into these biological aspects may facilitate the development of new drugs or therapies against CSCC and the other HPV-induced squamous cell carcinomas
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