【Amazing brain】之人脑前额叶背外侧皮质空间基因表达谱

10X Genomics Visium空间转录组的初探索

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编辑：陆瑶

校对：ANIMUS

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编者按：脑科学是最迷人的学科之一，也是最可能取得重大突破的学科，一直是全世界科学研究热点。随着8月29日埃隆·马斯克(Elon Musk)的脑机接口公司Neuralink直播展示了最新芯片植入猪脑后可探测小猪神经元的活动，读取脑部活动，未来可帮助解决许多神经系统问题，比如记忆力减退、中风、成瘾等，再一次掀起了全世界对脑科学研究热潮。而目前对大脑各功能区依然所知甚少，从分子水平理解其结构和功能对于脑重大疾病的防治具有重大战略意义。

爱丽慕斯学术团队专注于生命科学和医学前沿进展，探索心脑血管疾病和癌症的致病基因、发病机制和药物开发等，尤其是脑科学。作为本刊【Amazing brain】系列第一篇，这里解读全球首篇应用10X Genomics Visium空间转录组研究人脑前额叶背外侧皮质的空间基因表达谱的文章，助力脑科学前沿进展共享。

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本文总共2656字，建议阅读10分钟

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脑组织功能与其空间结构密切相关。其中大脑皮层具有经典的分层结构（L1~L6），不同层之间细胞表现出差异的基因表达模式，因而具有不同的形态、生理学和连接模式。而某些神经精神疾病也与特定皮层的基因表达、突触结构相关。因此，在细胞分辨率下定位人脑中的空间基因表达对于深入了解疾病机制至关重要。但目前广泛运用的单细胞测序技术，由于解离组织成单个细胞而丢失了组织中细胞的空间位置信息。而空间转录组作为一种近年来新兴的技术，可在组织切片上原位捕获RNA，并进行cDNA合成和测序，得到样本较为完整的基因表达空间图谱。

2020年2月28日，约翰霍普金斯医学院利伯脑发育研究所的Keri Martinowich和约翰霍普金斯彭博公共卫生学院生物统计学系Andrew E. Jaffe团队联合10x Genomics，在bioRxiv发表了题为“Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex”的论文，首次运用 10X Genomics Visium空间转录组技术研究人脑前额叶背外侧皮质（DLPFC），得到人脑各层皮质的基因表达谱，确定了大脑各层特异性表达基因，整合单核RNA测序（snRNAseq）数据完善了基因表达簇的空间信息，发现了精神分裂症和自闭症相关基因在脑不同层的富集，说明了基因空间表达与疾病密切相关。最后作者还开发了一个无监督聚类模型，可用于对那些解剖学定义不明的组织进行空间划分。

一 材料与方法

本研究共收集了3个神经功能正常的捐献者死后脑组织，选取前额叶背外侧皮层，垂直脑表面取样2对（4张）切片，每对包含直接相邻的2张切片，厚度为10μm，对与对之间相距300μm，总共12张切片（图1）。利用组织切片中灰质/神经元(SNAP25)、WM/少突胶质细胞(MOBP)和L5 (PCP4)的标记基因，勾画出第6层(L6)与相邻白质(WM)之间的边界，定位每个样本方向。

图1. 取材过程

二 绘制人脑DLPFC中基因表达概况

将所有样本进行空间转录组分析，检测到每个Spot平均有3.3个细胞、3,462条UMI和1,734个基因。利用标记基因进行t-SNE降维，将每个Spot归类到6个皮层及白质中。计算各层皮质每个基因的总表达量，得到每层基因表达谱。将以每个Spot为单位的基因表达谱，转化为以每层皮质为单位的基因表达谱（图2）。

图2. 计算各层皮质基因表达谱原理

三 寻找各层富集基因

得到各皮层的基因表达谱后，运用'Enrichment' model，即：比较每一皮层相对于其他6层，显著高表达的基因，定义为“层富集基因”。将此“层富集基因”与既往文献中已发表、或明确的层标记基因对比，发现只有59.5%的基因在本次研究中被证实为显著差异基因，同时，本实验中也发现了一些新的层富集基因。于是，作者使用多重单分子荧光原位杂交技术（multiplex single molecule fluorescentin situhybridization）进行验证，确认AQP4, HPCAL1, FREM3, TRABD2A,KRT17等层标记基因的表达（图3）。

图3. 多重原位杂交技术验证新标记基因

四 snRNA-seq/scRNA-seq亚细胞群空间位置注释

对人脑组织snRNA-seq/scRNA-seq数据注释其空间位置信息，有助于进一步了解细胞亚群的功能。因此，作者利用本实验室既往单细胞测序数据（2例人脑DLPFC组织，共5231个细胞核）进行聚类，在 7种广泛细胞类型中得到30个初级的细胞簇。利用各层皮质中显著富集的前100个基因，分析各层皮质和白质与亚细胞群之间，关于这700个基因表达谱的Pearson相关系数。最终，将少突胶质细胞（Oligo）主要定位于脑白质区（WM），星形胶质细胞（Astro）主要定位于L1，小胶质细胞（Mircro）、少突胶质前体细胞（OPC）主要定位于L1和WM，神经元较广泛地定位于L2~L6（图4~5）。为了进一步评估该 “空间位置注释”方法的稳定性，又应用其他单细胞数据集进行分析、对比，最终得到相似的细胞亚群定位结果。因此，作者认为该方法可为既往任何脑研究中的scRNA-seq或snRNA-seq数据集进行细胞空间位置信息注释。

图4. snRNA-seq/scRNA-seq数据空间注释原理

图5. snRNA-seq/scRNA-seq数据空间注释结果

五 疾病相关基因的皮层定位

为促进本研究结果临床转化，探究疾病发生发展机制，寻求更有效治疗方法，作者分析了包括自闭症谱系障碍（ASD）、精神分裂症（SCZD）等一系列脑疾病相关基因集的皮层定位，发现自闭症谱系障碍（ASD）相关基因集在特定皮层被富集（图6）。更有趣的是，如果将102个ASD相关基因按照不同临床表现归为53个与ASD主要特征相关的基因集（ASD53）和49个与神经发育延迟相关的基因集（ASD49），发现上述两者分别被富集到L5和L2（图7）。这表明疾病的不同临床亚型，可能是由不同部位的不同亚类细胞驱动的。

图6. 脑疾病相关基因集的皮层定位

图7. ASD不同临床症状的皮层定位

六 构建数据聚类模型

由于本研究中的人脑皮层结构及各层标记基因已被广泛研究、较为明确。除此之外，一些组织可能缺乏一定的解剖结构规律及标记基因。因此，针对这一情况，作者分别构建了3种“非监督”、“半监督”、“监督”的数据聚类方法。而非监督方法可用来分析空间结构不明确的组织，特别是那些与抑制神经元亚群、脑血管系统或免疫功能相关的组织，以便日后将空间转录组更可靠地应用于更广泛的研究。

图8. “非监督”、“半监督”、“监督”数据聚类方法

七 总结

本研究运用10X Genomics Visium空间转录组技术，绘制人脑DLPFC中各层基因表达谱并挖掘各层富集基因，运用富集基因对既往scRNA-seq/snRNA-seq数据进行空间注释，并将疾病相关基因定位于特定皮层，便于临床转化。最终构建机器学习模型，可更好地应用于其他组织的解剖学定义。

本文作为Visium空间转录组在脑科学应用的第一篇文章，展示了空间转录组在脑科学研究的思路，应用了很多新颖方法，具有非常重要的意义。爱丽慕斯学术团队计划推出【Amazing brain】系列，解读脑科学相关重磅文章。

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下期预告：小编解析【Amazing brain】系列第二篇，空间转录组研究阿尔兹海默症（AD）文章。

原文链接https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.28.969931v1

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参考文献

1. Maynard K，Leonardo CT, et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex.biorxiv.2020.02.28.