Mapping molecular subtype specific alterations in breast cancer brain metastases identifies clinically relevant vulnerabilities
绘制乳腺癌脑转移的分子亚型特异性改变可识别临床相关漏洞
发表期刊：Nat Commun
发表日期：2022 Jan 26
DOI: 10.1038/s41467-022-27987-5
一、背景
乳腺癌脑转移（BCBM）是一种常见的、侵袭性的转移扩散形式，而临床上相关的每一种乳腺癌亚型的治疗方案都很有限。乳腺癌细胞表现出特殊的可塑性，能够适应连续的治疗压力，以及巨大变化的微环境景观。这些适应性可以是即时的或延迟的，往往取决于肿瘤是ER阳性还是ER阴性。乳腺癌脑转移瘤在基因组和表型上都与原发性乳腺肿瘤不同。
许多研究利用三阴性和HER2+ve BCBM归属细胞系模型的基因表达谱来确定各种BCBM相关过程的驱动因素，其中一些与原发肿瘤的脑部无复发生存有关。另一方面，探索切除的BCBM肿瘤的基因组图谱以试图研究推定的驱动基因突变、克隆性和基因分歧。
二、材料与方法
1.数据来源
(1)样本：研究人群涉及来自三个独立机构的女性乳腺癌患者（45个患者，90个样本）
(2)乳腺癌转移的基因表达数据集：从NCBI的基因型和表型数据库（dbGaP）（登录号phs000676）下载以前发表的患者匹配的原发性乳腺与多器官转移性肿瘤的总RNA-Seq数据（N = 16名患者；68个转移灶）
(3)GEO：GSE1401764，GSE1401864和GSE14018
2.实验流程
(1)全外显子组DNA测序、复发性体细胞拷贝数改变的鉴定、体细胞突变的调用、识别驱动突变、肿瘤突变负担的估计、胚胎突变调用、外显子组捕获RNA测序、基因表达量的量化
(2)基因组疤痕分数的计算：基因组的不稳定性可以通过基因组疤痕分数来衡量；三个基因组疤痕分数：HRD杂合度损失（HRD-LOH）、大状态转换（LST）和端粒等位基因不平衡数（ntAI），每一个都是与HRD相关的染色体和基因组不稳定性的独立标记；HRD得分被定义为LOH、TAI和LST得分的未加权之和，HRD=LOH+TAI+LST
(3)BCBM相关基因组改变的数据集：使用dNdScv确定的局灶性体细胞拷贝数改变和具有统计学意义的体细胞驱动突变（q值<0.1），与以前报道的乳腺癌脑转移基因组改变进行交叉对比
(4)突变特征：来自匹配的正常-肿瘤突变的体细胞点突变被用于突变特征分析；使用Signal框架的最佳突变特征提取算法，从癌症的体细胞突变目录中提取突变特征
(5)无监督分层聚类：为了评估潜在的批次驱动效应，使用R中的hclust函数进行无监督层次聚类；使用WGCNA R软件包中的plotDendroAndColors()函数将样本聚类可视化为树状图，用临床病理变量注释样本树：疾病状态（原发性乳腺或脑转移）、测序批次（#1-5）、IHC的ER状态（ER+/-）、IHC亚型（ER+/HER2-、HER2+、TNBC和组织学亚型（IDC、ILC、其他））
(6)使用PAM50进行内在的分子亚型分类，分析亚型特异性差异基因表达
(7)DGE聚类和热图：使用R中的ComplexHeatmap进行无监督层次聚类和热图可视化；使用ward D2连接法对确定为差异表达的基因进行聚类，基于（1-Pearson相关系数）异质性距离指标，样本基于欧氏距离指标进行聚类
(8)加权基因共表达网络分析（WGCNA）：分别识别原发性乳腺癌和脑转移性肿瘤的亚型特异性基因共表达网络
(9)网络联合和可视化：对于每个分子亚型特异性分析，包含保留基因模块的网络被分配为图G1，包含差异性共表达网络模块的网络被分配为图G2
(10)基因组富集分析（GSEA）：为了确定与原发性乳腺肿瘤相比在脑转移瘤中明显富集或耗尽的功能过程和途径，GSEA被分别应用于从亚型特异性明显差异表达基因中确定的每个k-medoid簇（簇1，2）；基因模块的单样本GSEA(ssGSEA)
(11)基因组变异分析（GSVA）：使用GSVA R软件包，对RNA-Seq BCBM队列（N = 90个样本）中的每个样本的DNA修复途径基因组进行批量校正对数归一化计数（TPM），计算GSVA分数
(12)实验模型：患者来源的肿瘤移植模型、患者来源的肿瘤组织细胞
三、实验结果
01 - 亚型特异性BCBM转录组
到目前为止，BCBM的分子驱动因素还没有针对每个单独的临床乳腺亚型进行表征，可能缺少对该疾病的生物学和异质性的关键洞察力。为了绘制BCBM的亚型特异性改变，作者分析了患者匹配的原发性乳腺和脑转移的RNA和DNA样本，这些样本分别来自45名和39名患者的队列（图1a）。与以前的报告一致，观察到约27%（12/45）和22%（10/45）的病例有内在的分子亚型转换和临床亚型转换，从原发乳腺到BCBM（图1b-d）。
作者分析了肿瘤对的临床亚型，这些亚型表现出离散的转录程序（与患者匹配的原发病例相比，在BCBM中差异表达）（图2a）。鉴定了常见的差异表达基因（106个上调；379个下调）富集于与脑瘤微环境相关的途径，包括GFAP，胶质纤维酸性蛋白（反应性星形细胞的标志物），NR2E1（TLX）的基因靶点，核受体亚家族2组E成员1（编码蛋白调节成人神经干细胞增殖），和PTPRC，蛋白酪氨酸磷酸酶受体C（调节多个细胞过程的信号分子）（图2b）。
在临床亚型特异性转录组分析中，无监督聚类确定了不同的BCBM表达基因簇（图2c-e）。GSEA揭示了BCBM中管状亚型（ER+/HER2-）特异性的基因表达变化，富含下调的NOTCH、AKT和p53信号通路，肌形成（KLF2）和对氧反应相关通路上调。HER2+的BCBM显示焦点粘附细胞过程、ECM和神经活性配体-受体信号通路成员的下调。作者发现在HER2+的BCBM中，代谢和缺氧相关功能有明显的正向富集，主要是由ALDOA、GPI和ENO1基因的上调驱动。TNBC BCBM显示ITGAL、细胞毒性T细胞和干扰素-gamma相关途径的下调，细胞周期和LEF1转录因子WNT信号的上调。
从功能上讲，基因并不是孤立行动的，接下来利用WGCNA框架优先鉴定每个临床亚型的BCBM基因共表达网络。确定了腔镜（ER+/HER2-）的8个基因共表达模块（n = 197个基因），HER2+的9个模块（n = 231个基因）和TNBC亚型的4个模块（n = 229个基因），所有这些都存在于原发肿瘤和BCBM（图3a-c）。关注与BCBM改变的功能相关的基因网络，差异基因共表达网络分析（DGCA），进一步定义了17个luminal（n = 164基因），13个HER2+（n = 186基因）和3个TNBC（n = 34基因）差异基因共表达模块。总的来说，TNBC基因网络与腔镜和HER2+亚型相比差异较小，网络连接由原发性和BCBM中都存在的基因网络强烈驱动（图3d-f）。
为了探究这些模块是否是BCBM特异性的，而不是一般的转移性改变，作者分析了几个乳腺基因表达数据集，其中有多个注释的转移部位，包括脑、骨、肺、肝和其他部位。通过比较每个基因模块在脑部与所有其他转移部位的ssGSEA得分，发现79%的基因模块在BCBM中比其他部位明显富集（图4a，b和补充图7）。
这些模块的通路活动再现了每种临床亚型的一些已知特征，但也观察到了以前没有报道的通路的改变（图4c）。HER2+亚型大脑特异性基因网络显示TNF-α/NFK-α、INHBA介导的免疫反应、ECM蛋白和乳腺干细胞相关途径的下调。与HER2+ BCBM与匹配的原发性乳腺肿瘤的基因表达差异相一致和互补，一个模块（module_1）是大脑特异性的，富含ENO1介导的代谢重编程和mTORc相关信号。第二大HER2+BCBM特异性基因模块（module_2）显示补体级联（C1QA/B/C）的上调，NOTCH1（BIRC3、CD3G、CD74、CD2）、MYC目标（PTPRC、CD2、CD74）和T细胞受体信号的耗损。对于TNBC患者，BCBM特异性基因模块（c8_3）与SERPINF1、INHBA富集的细胞死亡和分化功能密切相关。TNBC基因模块1富集了与干扰素-γ反应、细胞周期G2/M期（VCAM1、IDO1）和T细胞分化（CARD11、LCK、B2M）功能相关的途径（图4c）。值得注意的是，在腔内队列中，一个BCBM特定的基因共表达网络模块（module_1）基因富集于有丝分裂细胞因子、P53信号传导、RB1基因和AURKA相关的细胞增殖功能和BRCA1介导的细胞周期调节（GO的管蛋白/染色质结合）（图4c）。此外，进一步用DGIdb类别对腔镜module_1网络基因进行人工注释，发现几个已知的DNA修复途径基因，包括BRCA1、BRCA2、CHEK1和AURKA（图4d）。总之，亚型特异性方法的协调暴露了转录组网络的不规则性，揭示了难以检测的和潜在的生物学意义的网络。
02 - 同源重组缺失在脑转移瘤中富集
作者接下来试图确定BCBM中的DNA改变是否影响了类似的途径。对18/45个BCBM病例（18个由BCBM和匹配的原发肿瘤和正常组织组成的三人组）进行了WXS，并分析了另外一个独立的BCBM WXS队列（N=21例）。患者匹配病例之间的体细胞拷贝数改变（SCNA）分析显示了共享和不同的大规模扩增和缺失（图5a，b）。值得注意的是，臂级扩增在原发性乳腺肿瘤中富集，脑转移特异性复发性臂级改变富集于拷贝数丢失和缺失。15个复发性病灶扩增区域与47个病灶缺失区域被确定为脑转移的显著改变（图5b）。基因水平的变体调用确定了BCBM的拷贝数变化，包括ERBB2、MYC、AURKA的扩增和肿瘤抑制基因如NF1、PTEN的缺失，以及TP53、PIK3CA和BRCA2的SNVs（图5c，d）。在大多数BCBM病例中，重要的SCNA区域（包括广泛和局灶性改变）主要由缺失组成，可能表明基因组的不稳定性。在BCBM肿瘤中观察到的基因组不稳定性，特别是缺失的普遍性，与DNA修复途径功能的可能缺陷相一致，也许反映了其他报道累积的治疗史。然而，在本研究数据集中，没有看到治疗类型或治疗次数对特定突变情况有影响的关联。
随后，作者使用最近描述的突变特征分析的器官特异性框架，调查了在BCBM中活跃的突变过程。总体而言，BCBM肿瘤由乳腺A（RefSigMMR1；错配修复缺陷（MMR））、乳腺F（RefSig18；报告的相关驱动突变TP53、APC、NOTCH和NFE2L2）、乳腺G（RefSig30；TP53驱动突变相关）、乳腺K（RefSig3；HRD相关；报告的相关驱动突变BRCA2、TP53、BRCA1、MYC、ARID1、NF1）和乳腺J（RefSig1; 老化相关；相关驱动突变TP53、KRAS、CDKN2B、CDKN2A、EGFR、SMA4、APC、BRD4）组成，少数肿瘤为乳腺D（RefSigMMR2；相关驱动突变CTNNB1、ALB）、乳腺B（RefSig2、APOBEC）和乳腺C（RefSig13、APOBEC；相关驱动突变TP53、PIK3CA、FAT1）（图6a，补充图9）。
与匹配的原发性乳腺肿瘤相比，乳腺A（MMR1）、乳腺K（HRD）和乳腺F的突变特征在BCBM中明显富集，乳腺J（老化相关）在BCBM中的相对贡献下降（图6b）。作者采用了一个基准策略来建立一个阈值来定义乳腺K特征状态。使用定义的相对贡献率大于0.9的临界值，在39个BCBM中的13个检测到了乳腺K，其中9个病例在匹配的原发肿瘤中没有乳腺K，这表明在BCBM中获得了HRD相关的特征（图6a和补充图9c）。有趣的是，在54%的腔镜型BCBM中发现了HRD突变特征乳腺K，与体细胞或种系BRCA1/2/PALPB2突变无关，其中31%为HER2+型，11%为三阴性亚型。发现21%的BCBM病例存在与其他BCBM富集突变特征相互排斥的乳腺K特征，与体细胞或种系BRCA1/2/PALPB2突变和肿瘤突变负担无关（图6a）。值得注意的是，只在2/13个HRDBCBM病例中观察到一个致病的生殖系BRCA2突变和两个体细胞BRCA2和/或PALB2突变，以及所有39个病例中BRCA1/2和PALB2基因的几个意义不确定的生殖系变异，它们与检测到的HRD相关特征没有关联（图6a）。同样，BRCA1、RAD51和RAD51C的转录水平在含有高水平HRD相关特征的BCBM样本中基本没有改变（补充图9e）。因此，这里检测到的HRD突变特征是独立于已知的生殖系和体细胞BRCA1/2和PALB2突变的。
为了进一步确定BCBM肿瘤中HRD的存在增加，作者还计算了一个组合基因组疤痕得分，这是一个与双链断裂（DSB）修复和HRD相关的基因组不稳定性的标志，包括HRD杂合度损失（HRD-LOH），大状态转换（LST）和端粒等位基因不平衡（ntAI）的数量。与匹配的原发性乳腺肿瘤相比，BCBM的 "基因组疤痕"综合评分明显增加（图6c，d）。有趣的是，在检测到乳腺K的BCBM病例中，11/13个BCBM样本也被基因组疤痕法称为HR缺陷（得分>41）。总的来说，DNA修复途径代表了富集在腔道和其他BCBM中的关键基因组依赖性，这些改变可能赋予了乳腺肿瘤的生存优势。
为了确定HRD是否在BCBM转录组中具有功能性，作者首先计算了完整的BCBM RNA-Seq队列中每个肿瘤的GSVA HR通路得分（N = 45个病人匹配的样本；图6e）。与基因组分析一致，在详细的HR通路分析中，相对于匹配的原发性乳腺肿瘤，在BCBM中检测到高的HR通路评分，HRD230（来自HRD肿瘤的230个基因签名），MMR和碱基切除修复（BER）通路的评分（图6e）。在对RNA和DNA进行分析的病例中，观察到大多数乳腺癌突变特征阳性病例也可以用基于RNA的HR途径分析来检测。值得注意的是，与基于突变的HRD方法类似，没有观察到这些通路的富集与疾病潜伏期之间的关联，其标志是无脑转移生存率（BMFS）或总生存率（OS）（图6e）。然而，BCBM在DNA和RNA水平上大量富集影响HR途径的分子改变，使BCBM患者成为PARP抑制剂治疗的潜在候选对象。
03 - HRD在BCBM中具有功能上的相关性
为了了解其生物学意义，作者使用患者来源的肿瘤外植体（PDTEs）和患者来源的类器官培养物进一步测试了HRD在管腔内BCBM中的功能。PDTEs是由3名乳腺癌患者的脑转移组织建立的。T347（ER+/HER2-原发乳腺到ER+/HER2在BCBM中扩增），T638（ER+/HER2-原发乳腺肿瘤到ER+；在BCBM中获得HER2表达，HER2未扩增），T328（原发乳腺和脑转移瘤中均为ER+/HER2-），以及来自其中两个样本的独立胸膜/肺转移材料HCI05（ER+/HER2+）和HCI-011（ER+/HER2-），均在乳腺脂肪垫中扩大。对这些患者的转移性肿瘤进行了WXS，以确定体细胞SNVs，利用Signal框架进行突变特征分析（图7a）。在三个BCBM模型中，检测到突变特征乳腺K（HRD）、乳腺E（类似于RefSig）、乳腺D（MMR2）和乳腺H（RefSig17）以及临床意义不明的体细胞BRCA1/2突变。HCI05和HCI11的乳腺K较低，另外还有乳腺I（RefSigN1；CTNNB1驱动突变相关）和乳腺J（RefSig 1），没有BRCA1/2突变。在T328、HCI05和HCI11中检测到乳腺G（TP53驱动突变相关）（图7b）。在有或没有PARP抑制剂（PARPi）、尼拉帕利的情况下，PDTEs被处理72小时，随后对ki67细胞增殖标记进行IHC染色。在T347和T638模型中观察到对尼拉帕利的明显抗增殖反应，但在T328、HCI05和HCI11模型中没有，这些模型通常携带乳腺G、TP53相关突变特征（图7c）。此外，使用RAD51的表达作为PARPi敏感性的指标，T347和T638模型显示出低的基础RAD51（表明HR途径缺陷和PARPi敏感性），在PARPi治疗时升高。PDTEs T328、HCI05和HCI11模型有很强的RAD51表达，在治疗中没有改变（图7d）。
使用腔道乳腺癌的类器官模型进一步扩展了本研究的观察（图7e）。让类器官系接受PARPi尼拉帕利的治疗，并评估细胞的生存能力。首先验证了所有的移植实验，并证明了PARPi在T638和T347模型中的反应（乳腺K高和乳腺G阴性），在HCI05和HCI11（肺/胸腔积液；乳腺K低/乳腺G高）没有反应（图7f，g）。此外，在来自乳腺K阴性模型、PDO-066和PDO-083（原发和卵巢转移）的患者衍生器官中，观察到对PARPi没有反应（图7g）。最后，在两个有乳腺K高/乳腺G高特征的模型（即PD-102和PDO-109）中复述了在T328中观察到的反应。与T328模型类似，看到对PARPi没有反应（图7g）。因此，了解特定的突变特征与RAD51在BRCA1/2/PALPB2野生型肿瘤中的表达的相对贡献，可能对预测腔内BCBM中对PARPi的反应有意义。
四、结论
本研究表明，独立于体细胞和种系BRCA1/2/PALB2突变的BCBM中存在功能相关的HRD特征，这为将PARPi的益处扩大到更多的患者群体提供了机会。总之，这项工作为以亚型特异性HRD转录组和基因组特征为指导的治疗干预开辟了进一步的转化途径，作者认为这些发现应该为未来的临床研究提供参考。