单细胞测序文献阅读及补充

Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications[1]

Abstract：

单个细胞是生物的基本构件，并且每个细胞都是唯一的，单细胞RNA测序已经已经成为分析细胞特异性和分解组织为细胞类型/状态的不可或缺的工具，可为我们揭示复杂的细胞事件并加深我们的理解。在这篇综述中，回顾了自2019年来发展的单细胞RNA测序技术来促进方法的选择，讨论了这个方法在不同生物学环境的应用。

1.单细胞测序方法总结

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单细胞测序方法通常有四步：

（1）单细胞或单核的分离和裂解；

（2）反转录；

（3）cDNA合成；

（4）测序文库制备。

前三步反应通常在一个管中进行以减少材料的损失，通常使用基于转座酶Tn5的碎片化进行最后一步的文库制备（如果cDNA还不是短片段）。

2.Tn5转座子的作用原理：

Tn5是一个原核复合转座子，由两个插入序列IS50R和IS50L组成，位于包含三个抗生素抗性基因的DNA区域的两侧。IS50具有19bp的倒置末端（外末端outside end，OE和内末端inside end，IE），而每一个IS元件由OE和IE组成。这两个野生型末端序列是半完美的重复序列，在19个碱基对中有7个碱基对有所不同。IS50L和IS50R均含有编码转座酶（TnP）以及转座阻遏蛋白（lnh）的基因，但由于IS50L中的碱基突变，造成翻译提前终止，所以仅有IS50R可以产生正常的有活性的TnP和lnh。Tn5的移动需要两个OE，而单个IS元素的移动需要一个OE和一个IE。

转座事件发生时，两个转座酶（Tnp）分子（绿色标注）结合到Tn5转座子的OE末端（黄色标注），形成两个Tnp-OE复合体，随后两个复合体通过Tnp的C末端相互作用进行联会，形成一个Tn5转座复合体，此时Tnp产生切割DNA的活性。随后Tnp利用切割活性，经过一系列化学反应切除供体DNA，离开供体链。当结合到靶DNA上时，Tn5转座复合体识别并攻击靶序列（Target site），将转座子插入到靶序列中，粘性末端通过DNA聚合酶、连接酶作用进行填补，两端形成9bp正向重复序列。整个转座过程完成了基因从原始DNA被剪切之后粘贴在另一受体DNA的过程，实现了基因的“跳跃”[2]。

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ATAC-seq：

只有转座子末端核心序列才是转座事件所必须的，因此我们将测序所需接头连接到末端核心序列，这样在建库过程中可以把DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为一步反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。和天然转座事件不同的是，人工建库过程中Tn5转座酶携带的是两条不相连的DNA，这样不仅可以让目标DNA带上接头，同时也对目标DNA进行了切割，实现DNA片段化[3][4]。

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未完。。。。

[1] Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications.(2017)

[2] Structure/function insights into Tn5 transposition.(2004)

[3] ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.(2015)

[4] https://mp.weixin.qq.com/s/mSWcecQZv6MOnf93OC31DA