单细胞测序初学者指南

自我们在科学的早期阶段就被告知，我们身体中的每个细胞都有完全相同的基因信息(除一两个细胞之外)。因此，如此多样化的细胞来自基因表达--每个细胞必须表达一组基因，并抑制另一组基因才能正常工作。即使我们有了这些知识，我们仍然很难确定哪个基因(或一组基因)对该细胞才是至关重要的。这不仅是因为技术上的困难，还因为细胞在不断变化，不断适应。因此，基因表达几乎就像薛定谔的猫。一个混乱的概念，很难理解，但非常有趣。这就是单细胞RNA测序的作用。

在当今这个转录组和基因组测序的时代，已经出现了非常棒的技术来观察发生了什么。RNA测序是一种非常棒的技术，通过将RNA反转录成为cDNA，我们可以量化，发现和分析RNA，尽管RNA测序给了我们很大的启发。但它也不是没有偏见的:大多数RNA测序是在组织样本或群体细胞上进行的。细胞间的生物差异可能会被误认为是技术噪音，或者被平均值掩盖。
然而，单细胞RNA测序(scRNA-seq)则更进一步。它的目的是拍下一个细胞在那个特定时刻所有基因表达的照片。从理论上讲，它使我们能够区分同一组织内细胞的表达——which is absolutely amazing!

scRNA-seq 测序是如何工作的？

细胞分离

首先是分离单细胞，获得单个细胞转录本的关键步骤是从群体细胞中分离出单个细胞。我们可以从游离的细胞悬浮液或组织样本中分离细胞。有许多方法可以用来分离细胞(流式细胞分选(flow-activated cell sorting)，显微操作法(micromanipulation)，光镊技术(optical tweezers)，微流体(microfluidics)和其他新兴的分离技术)。然而，我们必须时刻记住，这些方法是否与下游反应兼容。

scRNA-seq

得到单个细胞后必须分离RNA，这样我们就知道了在这个细胞中哪个基因在此刻表达了。我们不能直接测序RNA分子，所以我们必须跳出思维定势。这项技术利用逆转录酶将RNA反转录成cDNA。然后我们可以使用PCR扩增cDNA，并使用下一代测序技术对扩增的cDNA进行测序。因此，我们可以获得大量的数据。然后，必须通过专门为scRNA-seq数据设计的pipeline对原始数据进行处理和分析。我们必须始终记住，如果没有适当的根据实验环境处理，大量的数据并不意味着什么!整理完所有信息之后，就可以对细胞进行分析了。

scRNA-seq的应用

这项技术提供了关于我们细胞的信息:它的异质性和内部工作机制。它可以用于许多生物学领域，从基础研究到临床应用。从干细胞分化、胚胎发生、全组织分析，甚至在肿瘤领域的应用，它正在成为一个强有力的工具。事实上，它在2013年被《自然》杂志评为“年度方法”，而且它的受欢迎程度还在不断上升。然而，并非事事如意。

scRNA-seq的挑战

与任何其他技术一样，在执行此方法时，特别是在分析它提供的数据时，我们需要记住一些挑战。我们知道，RNA在我们的细胞中有很多功能，不同的RNA有不同的功能。它可能是调节功能，或者我们可能讨论的是信使RNA。无论哪种方式，RNA丢失都可能导致我们丢失一个低含量的转录本!同时，技术噪声与低丰度转录之间的鉴别仍然非常困难。因此，提高敏感度至关重要。因此，我们可以看到所有不同的RNA，并对其在细胞中的丰度有信心，因为它为我们提供了有关小调节(通常是低丰度)RNA的大量信息。

单细胞RNA测序提供了独特的见解

尽管仍有一些挑战需要克服，但毫无疑问，单细胞方法是前进的方向。通过观察一个特定的细胞，我们可以开始了解每个特定细胞在特定组织中的重要性! 通过观察局部你可以了解整体。